外泌体及与高血压的研究进展

星玉洁综述，任 明审校

0 引 言

据《中国心血管病报告2017》中国心血管病患病率及死亡率处于持续上升阶段[1]。据推算我国现有的心血管疾病患者为2.9亿，其中高血压患者推算有2.7亿[1]。心血管疾病已经严重威胁人类的健康及生活质量，因此寻求新的、更为有效的治疗方式迫在眉睫。越来越多的证据表明外泌体在心肌缺血、心肌梗死、心力衰竭、动脉粥样硬化、心脏瓣膜病等心血管疾病中均发挥着重要作用。外泌体之所以成为心血管领域的研究热点有三大原因：外泌体在生理调控过程中扮演着重要的角色，有作为诊断标记物以及治疗候选物的巨大潜能[2]。文章就细胞外囊泡、外泌体的生物特性、外泌体与高血压的相关研究作一综述。

2 细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)的概述

EVs是细胞释放到细胞外微环境的膜性囊泡，可携带母细胞来源相关生物分子，参与细胞间信号转导[3],具有强大的生物学功能。相关研究表明几乎所有物种的所有细胞均能分泌EVs，根据其释放机制及大小主要分为：外泌体(直径<150 nm)、微泡和凋亡小体(直径>100 nm),最后两种类型的囊泡分别从活细胞和死亡细胞的质膜直接释放出来[4]。

2 外泌体的基本生物特性

外泌体是最小的EVs，大小为30～150 nm不等[5]，含有脂类、蛋白质、RNA和DNA[6]。在电镜下可以观察到外泌体是由鞘磷脂、胆固醇、神经酰胺、磷脂酰丝氨酸等脂质成分构成的被双层包裹的囊状小泡[7]。外泌体的脂质双分子结构使外泌体含量可以稳定地保持，而不被各种循环酶消化。外泌体的形成是动态而有序的过程：首先由细胞膜内陷形成初级核内体,然后核内体膜进一步内陷形成多个腔内囊泡,即为次级核内体或多泡小体,多泡小体经过溶酶体途径后与细胞膜融合,再以胞吐的方式分泌到细胞外，即为外泌体[8]。外泌体的这种特殊的形成过程使其可以通过质膜运输和转运融合蛋白(Annexins、GTPas-es、Foltillin)、四跨膜超级家族成员(如CD81、CD82、CD63、CD9 等)，热休克蛋白(Hsp70、Hsp90)以及其他类型的蛋白(如细胞内源性蛋白质)[9]。

3 外泌体与非编码RNA(miRNA)的相关性

miRNA是单链内源性的非编码RNA，参与基因转录和翻译以及调节基因的表达。外泌体可以通过供体细胞转运miRNA至受体细胞，这是一种细胞间信息交流的新方式，miRNA还参与了人体内各种生理和病理过程，在心血管疾病的发生、发展中发挥重要的作用。相关研究发现miRNA在煮沸、低pH、高pH、室温状态下长期储存，甚至多次冻融等苛刻条件下均能稳定存在[10]；而与内源性miRNA所具有的稳定性相反，当合成的miRNA 被外源性加入时，很快会被血浆中高水平的核糖核酸酶降解，这表明内源性miRNA被某种机制保护以阻止其降解[11]。有研究表明miRNA可以被包装在EVs中或与RNA相关蛋白或脂蛋白复合物结合以防止其降解，来源于内皮细胞的外泌体可将miR-143和miR-145同时传递给平滑肌细胞，影响其血管功能[12]。miRNA的表达水平与许多心血管疾病相关基因的表达功能失调有关，然而外泌体在高血压的发生及发展中的具体作用和有关miRNA的表达谱仍需探索[13]。通过对源自心脏成纤维细胞的外泌体进行miRNA含量测定后发现许多miRNA通常在细胞内就发生降解，通过共聚焦显微成像技术和共培养试验确定了源自成纤维细胞外泌体的miR-21是一种有效的具有旁分泌作用RNA分子，可诱导心肌细胞肥大，并有作为治疗靶点的可能性[13]。Valadi等[14]发现巨噬细胞来源的外泌体携有121种不同的miRNA，其中一些miRNA在外泌体中的表达水平相对高于其供体细胞，这提示miRNA有向外泌体转移的机制。

Pegati等人证实细胞确实可以选择性释放以及保留部分miRNA，66%的miRNA的释放量能够反映它们在细胞内的水平，其中13%的miRNA被细胞选择性地保留(从而以较低水平释放)，而另一方面21%的miRNA则被主动释放[15]。

4 外泌体与高血压的相关研究

高血压是全球范围内的重要健康问题，是心血管疾病、卒中和慢性肾衰竭的主要危险因素。原发性高血压的发病机制十分复杂，遗传、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosteronesystem,RAAS)激活、内皮功能障碍、血管重塑、细胞膜离子转运异常和胰岛素抵抗均与高血压的发生有关，然而其潜在的分子机制仍待探索，这对制定更好的防治策略具有重要意义[16]。心脏压力负荷的增加可以引起心肌细胞肥大、成纤维细胞增生及细胞外基质蛋白和炎性细胞因子的分泌，而成纤维细胞和心肌细胞又可通过自分泌与旁分泌方式进一步促进心室重构。在心肌损伤、心脏机械负荷过重的作用下心脏发生重塑导致心肌纤维化、心肌质量增加、心肌间质成分增多和毛细血管相对减少使心肌增厚、心脏扩大，收缩功能逐渐降低，从而导致左室肥厚。相关研究证明高血压可增加心脏中聚集的巨噬细胞的量，而巨噬细胞来源的外泌体可激活内皮细胞中的促炎性信号通路，巨噬细胞早期浸润心脏是血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)所诱导的高血压心脏重构中的关键步骤。缺氧是心肌纤维化中的重要因素，缺氧还增加了前炎症细胞因子、趋化因子和黏附分子的表达，并增强了白细胞在血管中的聚集[17]， AngⅡ和缺氧是促炎性微环境的特征[18]。哺乳动物细胞分泌纳米大小的EVs作为细胞间通讯的非细胞工具[19]。各种类型的哺乳动物的细胞，如血小板、白细胞、上皮细胞、内皮细胞和肿瘤细胞等均能分泌EVs[20]。有研究以12周正常血压的Wistar-Kyoto大鼠和自发性高血压大鼠作为实验对象，使用离心速度(17 000×g)从缺乏血小板的血浆中分离出循环EVs，发现WKYs的循环EVs可以降低正常血压的血管舒张，但对SHRs的血压没有影响。相比之下，SHRs的EVs则不能降低WKYs和SHRs的血管舒张。WKYs的EVs对血管舒张的抑制作用可能是通过抑制其内皮细胞的NO合成酶来实现的，而来自正常人群的EVs也能抑制SHRs动脉的血管舒张，但高血压人群EVs则没有这种效果[21]。

5 外泌体对肾素-血管紧张素-醛固酮系统的作用

肾素-血管紧张素-醛固酮系统的激活是高血压的基础, 该系统由肾素、血管紧张素原、血管紧张素转换酶、AngⅡ、血管紧张素Ⅱ 1型受体(angiotensin type 1 receptor，AT1R)和血管紧张素Ⅱ 2型受体(angiotensin type 2 receptor，AT2R)组成。RAAS的终产物AngⅡ可引起血管收缩、血管平滑肌细胞增生、纤维化、心肌肥厚、交感神经兴奋性增加、心脏收缩力增强等，并且通过引发炎症反应促进血管通透性增加。AngⅡ还能通过启动炎症反应引起血管损伤和血管重塑。Piront发现在心脏压力超负荷下，心肌细胞会释放出肾素-血管紧张素-醛固酮系统的关键受体AT1R[22]，AT1R本身含具有丰富肾素的外泌体，它能够作用于心肌细胞、骨骼肌细胞和平滑肌细胞，并在神经激素刺激血管的过程中起调节作用。血管内皮细胞的增殖、迁移和存活均需要外泌体参与，目前是心血管和肿瘤研究的热点[23]。

6 尿外泌体的相关进展

肾功能受损并出现蛋白尿是临床上用于评估心血管疾病进程和肾功能恶化程度的重要指标。RAAS的激活会改变尿外泌体的含量，氯化钠共转运蛋白、α-上皮钠通道和γ-上皮钠通道与高血压的进展密切相关，高血压患者尿外泌体的miRNA分析也证实了miR-615、miR-211等几种miRNAs对血压波动敏感。总的来说，尿外泌体含量的研究在高血压的预后预测中有着广阔的应用前景。相关研究表明高血压患者无论是否已经出现蛋白尿，检测其尿外泌体中的蛋白(约21种)水平发现其与机体的粘多糖降解、凝血系统、补体系统和氧化应激水平密切相关[24]。如新发蛋白尿的高血压患者只有β-半乳糖苷酶表达增加，而甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2的表达下降；未出现蛋白尿的高血压患者尿外泌体中上皮生长因子水平增加、α-2巨球蛋白水平减少；出现蛋白尿患者尿外泌体中α-1抗胰蛋白酶、转铁蛋白和铜蓝蛋白表达增加。有研究表明外泌体中miR-146a的低表达与蛋白尿的存在有关，尿外泌体miR-146a可能是研究高血压早期肾损伤的潜在有用工具[25]。因尿液标本具有易于收集的优点，近年尿外泌体的相关研究也成为新的热点。

7 新一代测序在外泌体miRNA表达谱中的应用

Liu对SHRs及WKYs的血浆外泌体miRNA进行新一代测序发现了miRNA/总RNA比值并没有明显差异，但27种miRNA显示出差异性表达，其中在SHRs血外泌体中23种上调，4种下调。进一步利用基因分析发现差异性表达中表达最高的10种miRNAs(miR-378-5p/-187-3p/-383-5p/-486/-6329/-206-3p/-425-5p/-128-3p/-181c-3p/-6328/-486)可作为识别高血压的特异性靶基因或者信号途径(TGF-β及MAPK信号途径)。近期Linda Cambier在通过长期注射AngⅡ诱导的心肌肥大和肾损伤的模型中发现心内膜细胞源性的外泌体可延缓心肌肥大和心肌纤维化，可改善肾功能、减轻肾炎症和纤维化，这些作用与免疫抑制因子IL-10在血清、心脏、脾和肾中表达水平的改变有关[16]，外泌体及其包含的非编码RNA或许可作为治疗高血压相关的心血管和肾损伤的新疗法。

外泌体的最新进展及展望：外泌体具有生物相容性、生物屏障通透性、低毒性和低免疫原性等特性[26]，因此外源性miRNAs、小干扰RNA，甚至药物都可以被包裹到原始的外泌体中[6]。相关研究证实将治疗性miRNAs和小干扰RNA包埋到外泌体可通过以下途径实现：①用一个编码前体miRNAs/小干扰RNA的质粒或病毒转染供体细胞；②直接通过电穿孔将miRNAs或小干扰RNA合成到纯化的外泌体中[27-28]；③利用商业的转染试剂瞬时转染miRNAs[29]；此外超声波、挤压均可以增加药物装载的效率[30]。目前药物体外组装技术也在不断发展中，药物装载可采用3种不同的方法：①将药物直接并入纯化的外泌体，如亲脂小分子、低分子的抗氧化剂和抗癌药物；②将药物装载到供体细胞，并最终装载入外泌体；③通过编码DNA直接使药物表达。到目前为止，这些方法中的绝大多数都被应用于肿瘤学，目前通过外泌体治疗癌症的早期临床试验的数据仍有限。总的来说，尽管外泌体在作为心血管疾病的诊断标记物及治疗候选物方面有着令人期待的前景，但外泌体的形成、释放和清除方面还有许多问题仍待探索，还需要做大量的基础研究及临床调查[31]。