环状RNA在感染性疾病中的研究进展

黄 纪综述，李瑞曦，徐军发审校

0 引 言

环状RNA分子(circular RNA, circRNA)是一类在哺乳动物中广泛存在的，具有共价闭环结构的非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)，其结构稳定、高度保守，具有组织特异性和发育阶段特异性、比线性RNA更稳定等特点，广泛参与人类的生理和病理过程，其生物学功能非常复杂，包括作为微小RNA(microRNA, miRNA)海绵调控靶miRNA的作用、调控基因表达、与RNA结合蛋白互作、编码蛋白等重要功能[1]。近年来发现，circRNA参与肿瘤、神经系统疾病、心血管疾病等的发生发展过程[2-4]。在肺结核、病毒性肝炎、艾滋病等感染性疾病中也呈差异性表达，预示circRNA有可能作为疾病的标志和治疗靶标将在人类疾病诊断和防治中发挥重要作用。circRNA在感染性疾病中的研究尚不多，但已引起国内外研究者们的注意。肺结核、病毒性肝炎、艾滋病作为全球重大感染性疾病，探明circRNA在其发病机制的作用对全球人类健康具有十分重要的意义。现就circRNA在肺结核、病毒性肝炎、艾滋病等感染性疾病中的研究进展进行综述，为感染性疾病的基础研究及临床应用提供理论依据。

2 circRNA简介

circRNA从发现至今已有近半个世纪，经国内外研究者们最近10年的深入研究，其特征和生物学功能逐渐清晰地展现在人们面前，更多未知的特征与生物学功能仍需不断探索。

1.1circRNA的发现1976年，Sanger等[5]第一次提出circRNA的概念。但是，circRNA在发现初期被认为是错误剪接的产物，不被学术界所重视，因此关于circRNA的研究停滞了将近20年，直到Salzman等[6]在2012年发现circRNA在人类癌细胞和胚胎干细胞中是广泛存在的，使得circRNA再次成为研究焦点。

1.2CircRNA的特征与分类与普通线性RNA不同，circRNA缺乏5＇端帽和3＇端poly-A尾结构，以共价健首尾连接成不易被核酸外切酶RNase R降解的单链闭合环状结构[7]。circRNA在真核生物中广泛表达，且表达丰度高，结构稳定、高度保守，其表达具有组织特异性和发育阶段特异性，并广泛参与人类的生理病理过程[1]。以上特征使得circRNA可作为理想的生物标志物。

circRNA大部分源于基因的外显子区域，也有少部分由内含子形成[7]。根据成环方式的不同，circRNA可分为3种类型：外显子-外显子circRNA，内含子-内含子circRNA、内含子-外显子circRNA[8-10]。目前所研究的circRNA以外显子-外显子circRNA较多见。

1.3circRNA的生物学功能circRNA的生物学功能主要包括：①作为竞争性内源性RNA(competitive endogenous RNA, ceRNA)竞争性结合miRNA，从而影响miRNA对靶基因的调节作用，这是目前为止研究最为清楚的circRNA生物学功能；②调控基因表达；③与RNA结合蛋白互相作调节细胞的各种功能；④编码蛋白质并发挥各种生物学功能[11]。关于circRNA更多的特性和生物学功能需要进一步研究发现。

2 circRNA在感染性疾病中的研究进展

感染性疾病是由细菌、寄生虫、病毒或其他微生物感染引起的一类疾病，机体的免疫功能状态与其发病和进展十分密切，临床上主要通过实验室检查确诊，治疗手段以病原治疗为主。circRNA作为ncRNA的新星，吸引了不少学者投入到circRNA在感染性疾病的作用机制及靶向治疗的研究中，目前涉及circRNA研究的感染性疾病主要包括肺结核、病毒性肝炎和艾滋病。

2.1肺结核结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性感染性疾病，可侵及多个器官，以肺部结核分枝杆菌感染最为常见。结核分枝杆菌首先感染肺泡巨噬细胞，并隐匿于巨噬细胞内，导致潜伏感染并形成慢性肉芽肿。当潜伏感染者免疫力低下时，可发展成活动性肺结核。患者病症主要有低热、盗汗、乏力、消瘦等，呼吸道症状主要有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛等。目前临床上诊断肺结核的方法包括胸部影像学检查、痰涂片抗酸染色检查、结核分枝杆菌核酸检查、结核菌素皮肤试验、γ-干扰素释放试验、结核分枝杆菌抗体检查及支气管镜检查。

目前circRNA在活动性肺结核中的研究主要集中在生物标志物的开发上。Zhuang等[12]通过高通量测序技术首次发现hsa_circ_0005836和hsa_circ_0009128在活动性肺结核患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中表达较健康对照组明显下调，并提出hsa_circ_0005836和hsa_circ_0009128可作为诊断活动性肺结核的新生物标志物。该研究首次发现活动性肺结核与体内circRNA的差异表达相关，为活动性肺结核的诊断和治疗提供了新的思路。此外，该团队还发现PBMC中的hsa_circ_0001380也可作为诊断活动性肺结核的生物标志物[13]。除了该团队外，Huang等[14]发现circRNA的表达水平在单核细胞源性巨噬细胞感染结核分枝杆菌后也发生了改变，其中32个circRNA上调，110个circRNA下调，提出hsa_circ_0043497和hsa_circ_0001204可作为未来诊断活动性肺结核的有效生物标志物。该团队继续深入研究[15]，在活动性肺结核患者PBMC中发现了37个差异表达的circRNA，其中hsa_circ_001937、hsa_circ_009024、hsa_circ_005086表达较健康对照组显著升高，而hsa_circ_102101、hsa_circ_104964、hsa_circ_104296表达较健康对照组明显下降，hsa_circ_001937具有最大的受试者工作特征曲线下面积(AUC)(AUC=0.873,P<0.001)。此外，hsa_circ_001937在活动性肺结核患者PBMC中的表达较肺炎、慢性阻塞性肺疾病和肺癌患者明显上调，且在治疗后显著下调。因此提出hsa_circ_001937可作为诊断活动性肺结核的生物标志物。Fu等[16]在活动性肺结核患者PBMC中发现171个失调circRNA，其中circRNA_103017在患者中表达上调且最具有诊断活动性肺结核的价值。同时，Qian等[17]通过检测活动性肺结核患者PBMC中的circRNA发现多个通路内的circRNA表达发生异常，包括细胞因子-细胞因子受体通路、趋化因子信号通路、神经营养素信号通路和上皮细胞的细菌侵袭通路，选择其中7个差异表达的circRNA(7-circRNAs)作为联合诊断活动性肺结核的生物标志物，并通过一组独立样本验证了7-circRNAs的诊断效能，其AUC为0.946(P<0.001)，同时活动性肺结核患者的结核病指数明显高于健康组。因此，提出7-circRNAs可作为诊断活动性肺结核的可靠生物标志物。最近，Zhang等[18]发现hsa_circ_0028883也可作为诊断活动性肺结核的生物标志物。

除在PBMC中的研究外，有学者发现血浆中circRNA也具有作为活动性肺结核生物标志物的潜能。Yi等[19]发现在活动性肺结核患者血浆中存在75个明显失调的circRNA，并通过qRT-PCR验证了hsa_circRNA_103571在患者中是显著下调的，最后通过受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve, ROC)分析提出hsa_circRNA_103571在诊断活动性肺结核中具有重要价值。Huang等[20]发现活动性肺结核患者血浆hsa_circRNA_0001953和hsa_circRNA_0009024的表达水平与其肺结核严重程度呈正相关关系，二者联合诊断活动性肺结核的AUC为0.915，并且治疗后患者血浆hsa_circRNA_0001953和hsa_circRNA_0009024表达水平明显下降，因此提出hsa_circRNA_0001953和hsa_circRNA_0009024可作为诊断活动性肺结核的可靠生物标志物。此外，Huang等[21]也提出血浆中的hsa_circ_0001204和hsa_circ_0001747可作为诊断活动性肺结核的生物标志物。在活动性肺结核患者中，不同研究者发现的失调的circRNA数目及种类不一致，可能与研究所选取的患者数量少及严重程度、性别及年龄不同有关，应在原有的研究基础上扩大检测患者数目及种类，以进一步明确可作为活动性肺结核诊断标志物的circRNA指标。

此外，关于活动性肺结核发病机制中的分子网络研究也有不少涉及circRNA。Zhang等[22]通过鉴定3例活动性肺结核患者及3例健康人全血中circRNA确定了circRNA在血液中的表达模式及在活动性肺结核发病机制中的分子网络，发现多个免疫通路可能参与了活动性肺结核的发病过程，其中包括内吞途径信号通路、促分裂原活化蛋白激酶信号通路、人类T细胞白血病1型病毒感染信号通路、泛素介导的蛋白水解信号通路等。该研究还构建了circRNA-miRNA-mRNA分子网络，并预测circRNA可能作为miRNA海绵参与机体抗结核感染过程，该研究将为circRNA抗结核感染的分子机制提供更多可用信息。Fu等[16]发现circRNA_101128在活动性肺结核患者PBMC中的表达与其下游靶标let-7a水平呈负相关关系，且生物信息学分析显示circRNA_101128可能通过调控let-7a参与MAPK和PI3K-Akt信号通路，因此提出PBMC中的circRNA_101128-let-7a相互作用可能在抗结核感染中发挥重要作用。Yi等[19]发现在活动性肺结核患者血浆中下调的hsa_circRNA_103571与活动性肺结核相关miRNA(如miR-29a, miR-16)可能存在相互作用，通过生物信息学分析发现hsa_circRNA_103571主要参与RAS信号通路、调节肌动蛋白细胞骨架、T细胞及B细胞受体信号通路，因此hsa_circRNA_103571-miRNA-mRNA的相互作用可能为活动性肺结核发病机制提供新的研究方向。

最近，本课题组发现circRNA TRAPPC6B(circTRAPPC6B, 首次报道时名为hsa_ circ_0005836)可通过靶向miR-874-3p调控自噬蛋白ATG16L1表达，从而诱导巨噬细胞自噬并抑制巨噬细胞内结核分枝杆菌生长，因此提出调控circTRAPPC6B或miR-874-3表达均可作为抗结核的治疗手段(文章在审稿中)。该研究是circRNA在结核病领域的首个功能性研究，circRNA在结核病发生发展中更多的作用仍需要不断地探索。

以上研究发现，血浆、PBMC中的circRNA对活动性肺结核具有潜在的诊断价值，且生物信息学分析显示其可通过circRNA-miRNA-mRNA分子网络在活动性肺结核发生发展过程中发挥调控作用。除继续开发血浆、PBMC中circRNA作为肺结核诊断标志物的潜能，circRNA在唾液、痰液等无创途径采集的体液中的作用及其分子机制也有待探究。

2.2病毒性肝炎病毒性肝炎是一种由肝炎病毒感染引起的以肝病变为主的感染性疾病，其中以乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染最为常见，临床上主要通过肝炎病毒学检查确诊。慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)发病的免疫学机制尚未完全阐明，主要涉及病毒免疫逃逸和宿主免疫耐受两方面。关于circRNA在乙型肝炎中的作用尚处于起步阶段，主要集中在circRNA的差异表达及其调控网络预测上。曹琳等[23]通过检测CHB患者、慢性HBV携带者及健康体检者PBMC发现137个差异表达的circRNA，这些差异表达的circRNA可能通过影响相关miRNA分子的靶基因及信号通路参与慢性HBV感染者的免疫调控。Zhou等[24]通过分析未治疗CHB患者及健康体检者肝组织发现99个差异表达的circRNA约有80%源于蛋白编码基因，并选取其中8个circRNA通过qRT-PCR在8组CHB患者肝组织及正常组织中进行了验证。随后通过生物信息学预测了4条circRNA-miRNA-mRNA分子网络，包括hsa_circ_0005389-miR-4505/miR-6752-5p/miR-5787-IRF7，hsa_circ_0000650-miR-6873-3p- -TGFB2，hsa_circ_0000650-miR-210-5p-HBV和hsa_circ_0000038-miR-370/miR-939-HBV。其中hsa_circ_0000650与TGFB2呈强正相关关系，而与miR-6873-3p呈负相关关系，揭示hsa_circ_0000650可能通过miR-6873-3p调控与TGFB2的相互作用。可见，差异表达的circRNA可能通过circRNA-miRNA-mRNA分子网络参与CHB的发生和发展，有望为CHB发病和发展的分子机制提供新的研究方向。

20%～30%的CHB患者可能发展为肝硬化和或肝癌，因此也有研究者探讨了circRNA在HBV相关性肝癌中的作用。Cui等[25]在HBV相关性肝癌组织及其癌旁组织中发现47个差异表达的circRNA，这些差异表达的circRNA可能参与HBV相关性肝癌的发生发展。Zhu等[26]通过分析10例HBV相关性肝癌患者及5例HBV肝硬化患者血浆中circRNA，并通过进一步qRT-PCR验证及ROC分析提出血浆hsa_circRNA_0027089可作为诊断HBV相关性肝癌的新的生物标志物。除作为生物标志物外，circRNA可通过circ-miRNA-miRNA分子网络参与HBV相关性肝癌的发生发展。Wang等[27]通过分析HBV相关性肝癌组织及其癌旁组织发现24个circRNA上调，23个circRNA下调，其中 hsa_circRNA_100381、hsa_circRNA_103489及hsa_circRNA_101764的表达具有显著性差异。生物信息学分析circRNA-miRNA-mRNA分子网络发现hsa_circRNA_101764的大部分靶基因参与PI3K-Akt信号通路调控。该研究表明hsa_circRNA_101764可能在HBV相关性肝癌中发挥重要作用。Huang等[28, 29]发现HBV相关性肝癌组织中上调的circRNA-10038可作为HBV相关性肝癌的诊断标志物，其可通过circRNA-10038-miR-141-3p/RHEB轴激活mTOR信号通路，与患者的预后不良相关。此外，Yu等[30]发现血浆中hsa_circ_0000976、hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897联合诊断HBV相关性肝癌的诊断效能高于传统肝癌生物标志物甲胎蛋白。

目前，虽然已在HBV相关性肝癌研究中发现部分circRNA可作为诊断标志物，但仍未有报道可作为CHB诊断标志物的circRNA。另外，circRNA在CHB中的分子调控网络及机制仍需研究者们探索。

2.3艾滋病人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)是一种能够导致获得性免疫缺陷综合症(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)的逆转录病毒。HIV在人体内的平均潜伏期为8～9年，人类免疫系统中的CD4+T淋巴细胞是其攻击的主要目标，使人体丧失免疫功能，最终引发全身性感染。有关circRNA与AIDS发病的相关性报道少见，Zhang等[31]通过分析早期(HIV感染6个月内)未治疗的HIV感染者PBMC发现1365个差异表达的circRNA，其主要参与免疫调节、炎症反应、干扰素-γ信号调节、抗病毒反应等生物学过程，并预测了可能通过circRNA-miRNA-mRNA分子网络影响HIV复制的差异表达circRNA，为HIV早期感染的发病机制和抗病毒治疗提供新的潜在靶点。

2.4其他感染性疾病除肺结核、病毒性肝炎、艾滋病以外，circRNA在某些寄生虫、病毒及其他微生物感染中的研究也有零星报道，这些研究将进一步完善circRNA在感染性疾病发病机制中发挥的功能。

2.4.1寄生虫感染疟疾在世界上分布广泛，是严重危害人体健康的寄生虫病之一。据统计，全球有2.28亿疟疾患者[32]。Broadbent等[33]通过分析红细胞内期的恶性疟原虫发现其体内具有大量circRNA，并验证了其6个circRNA，发现这6个circRNA均含有预测的人类miRNA结合位点。结合目前关于circRNA的研究，恶性疟原虫体内的circRNA可能通过靶向人类miRNA调控其在人体内的繁殖过程。

弓形虫是细胞内寄生虫，其包囊可随着血液循环到达全身各部位，破坏大脑、心脏、眼底等器官和组织，致使人的免疫力下降。Zhou等[34]发现弓形虫感染后的小鼠大脑细胞circRNA表达发生了改变。其中，在急性感染的小鼠大脑中有9个circRNA上调和67个circRNA下调；而在慢性感染小鼠大脑中有2个circRNA上调和1个circRNA下调。基因本论(gene ontology, GO)分析显示，在急性感染小鼠大脑中产生失调circRNA的宿主基因主要参与对刺激和离子结合活性的反应。

2.4.2病毒感染病毒性肺炎常由流行性感冒病毒感染导致，其他如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、副流感病毒、腺病毒、柯萨奇病毒等也可引起病毒性肺炎。Shi等[35]发现人胚肺感染了单纯疱疹病毒-1后circRNA发生了改变，并通过生物信息技术预测了这些差异表达的circRNA在circRNA-miRNA-mRNA分子网络中可能参与的调控机制。Lou等[36]在巨细胞病毒潜伏感染及模拟感染的人白血病单核细胞(THP-1)中发现大量差异表达的circRNA，并通过AUC分析提出hsa_circ_0001445和hsa_circ_0001206可作为诊断巨细胞病毒感染的生物标志物。这些差异表达的circRNA是否参与机体抗病毒感染的调控仍需进一步证实。

尖锐湿疣是有人类乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)感染引起的增生性病变，主要通过性接触传播。薛燕等[37]通过circRNA微阵列芯片技术发现尖锐湿疣组织内存在多个差异表达的circRNA，进一步生物信息学分析显示尖锐湿疣组织内表达下调的hsa_circRNA_104121可能通过调控hsa-miR-143-3p引起上皮细胞的异常生物学行为。

登革热是由登革热病毒通过被感染的埃及伊蚊叮咬传播引起的急性感染性疾病，在热带和亚热带地区尤为普遍。He等[38]通过分析登革热患者治疗前后外周血白细胞内circRNA变化，发现hsa_circ_0006459及hsa_circ_0015962不仅可作为登革热病毒感染的潜在生物标志物，还与登革热的预后相关。

2.4.3沙眼衣原体感染沙眼衣原体是一类专性寄生于真核生物细胞内，具有独特发育周期的原核细胞型微生物，不仅可致眼部感染，还可引起泌尿生殖道感染、性病淋巴肉芽肿和其他器官感染。Liu等[39]通过分析沙眼衣原体感染的HeLa细胞发现大量失调的circRNA，并通过生物信息学分析表明这些差异表达的circRNA可以靶向胞吞作用、MAPK和PI3P-Akt信号通路，为宿主细胞内circRNA参与了沙眼衣原体的感染过程提供了证据。

3 结语与展望

circRNA具有保守性、稳定性、特异性等特征，生物学功能丰富多样，可能是更为理想的生物标志物。circRNA不仅可作为感染性疾病的生物标志物，而且生物信息学分析显示在感染性疾病中差异表达的circRNA可通过circRNA-miRNA-mRNA分子网络参与感染性疾病的发生发展。当前，circRNA在感染性疾病中的研究深度和广度远远不及其他类型疾病，仍有许多感染性疾病未涉及circRNA相关研究。此外，circRNA在感染性疾病中的研究大部分仅在circRNA差异表达的阶段，其功能性研究报道有且仅有一篇。未来，更多的感染性疾病研究将加入到circRNA研究队伍中，circRNA有望成为感染性疾病的候选诊断标志物，其在感染性疾病发生发展中发挥的功能也将会进一步明确。相信，随着对circRNA在不同感染性疾病中的深入研究，circRNA将为感染性疾病的预防及诊疗提供新思路和新策略。