免疫检查点抑制剂耐药机制的再认识

汪步海

0 引 言

多个免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor, ICI)不断获批上市，为越来越多的晚期恶性肿瘤患者带来了长期生存的希望；但是ICI的耐药仍是目前患者生存获益的最大障碍。有大量患者对于阻断免疫检查点的治疗没有明确反应，此为原发性抵抗。另有许多最初对治疗有反应的患者，最终仍面临疾病进展，此为获得性抵抗。

对于肺癌， Keynote042研究显示在细胞程序性死亡-配体1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)1%的患者人群中，ICI单药原发性耐药比例高达73%[1]。Keynote189研究显示ICI联合化疗在总体人群的原发耐药比例也高达52%[2]。免疫治疗可以为患者带来一定概率的长期生存可能，但整体5年生存率不到30%[3]。这意味着多数患者最终会经历耐药。因此探明耐药机制并据此制定克服耐药的治疗策略对于ICI未来的临床应用具有重大战略意义。

1 耐药机制的分类

免疫耐药分为原发性耐药、适应性耐药以及获得性耐药3种[4]。原发性及适应性耐药在临床表现上均表现为患者对抗肿瘤免疫无反应。但是原发性耐药机制与适应性耐药机制不同。原发性耐药机制单纯指患者无抗肿瘤免疫反应，起始治疗无反应。适应性耐药机制为患者存在抗肿瘤免疫反应，但是存在适应性的耐受机制，从而在临床上未表现出对治疗的应答反应。获得性耐药在临床上表现为患者起始对免疫治疗有反应，但在后期治疗中出现进展。因此，获得性耐药机制中，肿瘤后天性获得了某种抵抗本领，从而产生对免疫治疗的抵抗。

2 免疫耐药机制的空间维度

现有的研究表明，肿瘤细胞内、外多种因素的参与导致了耐药的发生[4]。

肿瘤细胞外因素主要是肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)中大量的免疫相关负性调控细胞侵润，抑制了T细胞的活化。这些细胞包括调节性T细胞(Tregs)、髓源性抑制细胞(myeloid derived suppressor cells，MDSCs)、M2+巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞(tumor associated fibroblasts，TAF)、肿瘤相关中性粒细胞(tumor associatedneutrophils，TAN)等[5]。此外，TME中的一些可溶因子包括免疫抑制细胞因子、代谢物等，以及缺氧和pH值的降低也都参与了免疫逃逸[5]。TME内缺少肿瘤浸润的T淋巴细胞(tumor infiltrating cells,TIL)呈现沙漠化微环境状态，使得ICIs失去效应细胞。总体来说， 肿瘤外因素的耐药机制主要分为： 免疫负性细胞浸润，例如Tregs、MDSC、TAM；抑制性检查点分子增加，例如CTLA-4、PD1、TIM3、LAG3；促进性免疫检查点分子减少，例如4-1BB、OX40；免疫抑制性细胞因子存在，例如代谢物血管内皮生长因子-α( vascular endothelial growth factor,VEGFA)、吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2, 3-dioxy-genase, IDO)的释放。

肿瘤内因素主要是肿瘤细胞内的环境改变，通过调节某些基因和通路在细胞内的表达，改变肿瘤的特性，使其逃避免疫系统的杀伤。近年来已经发现了多种肿瘤内在的抵抗机制，包括：①肿瘤抗原表达丢失，导致T细胞缺乏反应，在抗原递呈的过程中，肿瘤细胞通过修饰抗原，改变抗原递呈机制等逃避抗原递呈，最终导致肿瘤逃避杀伤[6]；②通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途径和/或磷酸酶和张力蛋白同源基因 phosphatase and tensin ho-molog deleted from chromosome 10， PTEN)表达丢失，增强磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)信号及下游通路，促进肿瘤生长，对ICI治疗抵抗[7]；③Wnt/β-catenin信号通路的过表达，激活靶基因；WNT通路中β-catenin的过度表达被发现与黑色素瘤中肿瘤特异性T细胞的浸润减少密切相关[8]；④干扰素-γ(IFN-γ)信号通路丢失，导致下游免疫反应无法启用[9]。

3 免疫耐药机制的时间维度

免疫反应的过程大体可以分为肿瘤抗原的释放、提呈，T细胞抗原识别及T细胞活化，T细胞效应3个阶段[10]。

3.1T细胞抗原识别障碍肿瘤释放特异性抗原，从而激活免疫系统产生免疫反应。若肿瘤特异性抗原发生改变，或失去抗原性，或不能被递呈，那么T细胞便识别不了该抗原，肿瘤细胞从而逃避了免疫细胞的杀伤[10]。Anagnostou等[11]随访观察42例经ICI治疗的NSCLC患者，对其中4例耐药的患者进行耐药前后病理组织对比分析，发现在免疫治疗的过程中，肿瘤原有突变消失，出现更复杂的新生突变。这种耐药不依赖PDL1通路，也与T细胞的浸润程度无关。Zaretsky等[12]对1例PD-1治疗耐药的患者前后样本进行全外显子测序发现，β2M 的突变导致了肿瘤细胞表面抗原提呈障碍，肿瘤抗原无法正常提呈到细胞表面。另外，人类白细胞抗原 (human Leucocyte antigen，HLA )基因的变异导致主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)分子呈现多样性，在肿瘤细胞抗原提呈上呈现亚克隆改变，从而逃避先前活化的细胞毒性 T 细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)杀伤。肿瘤细胞表观遗传修饰也影响抗原的加工和提呈。

3.2T细胞活化障碍T细胞的活化离不开抗原递呈细胞(antigen presenting cell ，APC)的抗原递呈和激活。在此过程中，树突状细胞(dendritic cell,DC)细胞浸润减少，APC缺乏、共刺激信号表达缺失等都会影响到T细胞的活化[11]。有研究发现，Wnt/β-catenin通路与DC细胞的浸润减少有关[13]。β-catenin可通过促进转录激活因子(activating transcription factor 3，ATF3)的转录，抑制趋化因子(C-C 基元)配体4[chemokine (C-C motif) ligand 4，CCL4]基因表达，从而导致CD103+DC浸润减少。

3.3T细胞效应功能障碍肿瘤微环境中多因素均会改变、影响T细胞最终的杀伤效应，使得T细胞出现效应障碍[10]。肿瘤微环境中，目前已知诱使活化T细胞性能改变的因素有：①癌基因信号通路异常或基因缺失。例如BRAF基因是MAPK信号通路的一个重要转导因子，BRAF突变可促进IL-1α、IL-1β和抗血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)等因子分泌，上调肿瘤相关纤维细胞中PD-L1/PD-L2表达，进而抑制T细胞浸润及活性[14]。②IFN-γ信号通路异常。IFN-γ可诱导有效的抗肿瘤免疫应答，若其信号通路发生改变，则影响免疫应答。IFN-γ信号通路目前已知会发生的改变主要有：下游信号JAK1/2分子失活突变、IFN-γ信号通路持续活化等[15]。③ Tregs、MDSCs、TAM的诱导。免疫负调控细胞髓系来源的细胞(Myeloid-derived suppressor cells ,MDSCs)诱使TGF-β增加导致获得性耐药[16]。④免疫应答激活引起的PD1/LAG3等免疫抑制性分子表达上调。⑤持续的PD-L1表达介导耐药[17]。

4 免疫耐药的监测及应对策略

4.1 免疫耐药的检测针对免疫耐药的检测，需要首先明确和选择可以预示耐药的标志物。患者的突变负荷状态、驱动基因突变情况、其他伴随基因的表达情况、微环境中CD8+T细胞浸润的情况、PD-L1表达情况、T细胞克隆类型等[4]，或可以为耐药提供有价值的信息。

2017年，Chen等[18]对肿瘤的微环境进行了分类。根据免疫细胞的浸润状态、促炎及效应因子的存在状态等，将肿瘤微环境分为3种类别：免疫炎症型、免疫排除型、免疫沙漠型。免疫沙漠型及免疫排除型肿瘤常常意味着免疫治疗疗效不佳。肿瘤突变负荷(tumor mutation burden, TMB)是研究比较深入的一个预测指标。TMB低的患者常被认为肿瘤新抗原产生较少，从而不利于免疫细胞的激活和杀伤[19]。同理，微卫星稳定(Microsatellite Stability, MSS)等基因状态有可能使得肿瘤突变变少，从而影响新抗原的产生[20]。此外，肿瘤基因拷贝数的改变也可以预示耐药的发生。 2018 ASCO大会报道了郭军教授团队的一项研究，该研究对国内13例使用PD1单抗治疗的黑色素瘤患者进行疗效比对，结果发现，经全外显子测序，CR + PR组(complete remission，CR，完全缓解；partial remission，PR，部分缓解)与PD组(progressive disease, PD，疾病进展)存在部分基因拷贝数扩增的差异，PD组中存在几个显著的基因拷贝数的扩增，如1q23.1、5p15.33、7p22.3、11q13.3和12q14.1，其基因位点包含Cdk4、Ccnd1、CARD11和Mtor等基因[21]。

超进展是免疫治疗疾病进展的一个特殊类型。有研究报道，经免疫治疗的患者超进展的发生率在8%～29%，每个瘤种发生超进展的比率也不一样[22]；发生超进展的患者预后往往更差[23]。因此大量的研究在探讨超进展的特征指标，以期望能提前分选患者。目前发现，高龄(>65岁)、基线转移病灶数量、MDM2/MDM4、EGFR状态等跟超进展的发生有一定的相关性[23]。

针对免疫耐药的监测，需要在治疗前了解患者的基线微环境状态，以及在治疗过程中实时动态的检测肿瘤微环境的分子改变。通过监测肿瘤组织的基因及蛋白组学状态、淋巴细胞功能状态、血液(外周血单核细胞)、排泄物的微生物组学、口腔的微生物组学等，了解微环境的动态变化，提前给予耐药的预警[4]。

4.2免疫耐药应对策略联合治疗是目前防止耐药或克服耐药的最重要应对策略。常用的联合治疗模式有：免疫联合化疗、免疫联合放疗、免疫联合抗血管生成治疗以及免疫联合免疫治疗等。

4.2.1免疫联合化疗免疫联合化疗治疗肺癌的方案已经被广泛探索。化疗药物直接作用于肿瘤细胞，杀死肿瘤细胞并促进肿瘤抗原的释放，从而更好的进行抗原递呈及T细胞活化。Keynote189研究探索了帕姆利珠单抗联合培美曲塞及铂类一线治疗驱动基因野生型非小细胞肺癌患者，并取得了不错的疗效[24]。IMpower130研究探索了阿替利珠单抗联合卡铂及白蛋白纳米紫杉醇在非小细胞肺癌中的疗效，最终取得了无进展生存期(progression free survival，PFS)、总生存期(overall survival,OS)双阳性的结果[25]。在小细胞肺癌中，阿替利珠单抗联合依托泊苷及顺铂的一线治疗方案也最终取得了双阳性的结果[26]。目前，初治患者使用PD1/L1抑制剂联合化疗已经成为肺癌患者治疗的新推荐。

4.2.2免疫联合放疗放疗作为一种直接杀死肿瘤的治疗措施，也被认为有着很好的促进抗原释放的作用。局部照射可以诱发全身的免疫介导的抗肿瘤效应[27-29]。 此外，局部放疗和免疫调节的结合可以通过增加肿瘤抗原释放、促进抗原提呈细胞(antigen-presenting cells, APC)交叉提呈、改善树突状细胞(dendritic cell, DC)功能和启动T细胞等来达到局部控制及引起远隔效应[30]。PACIFIC研究探讨了在Ⅲ期非小细胞肺癌患者同步放化疗后使用度伐利尤单抗维持治疗的效果和安全性。结果显示，在同步放化疗之后使用免疫治疗，显著的延长了患者的PFS和OS[31]。目前，仍有许多放疗同步或序贯PD1/PDL1抑制剂的临床研究正在进行中。

4.2.3免疫联合抗血管治疗在免疫排除型肿瘤中，CD8+T细胞常常浸润不到肿瘤组织内，仅存于肿瘤周围。因此，针对该类肿瘤的免疫状态，需要帮助T细胞进入肿瘤组织，例如利用抗血管生成治疗使瘤内血管正常化，打通输送系统。IMpwer150研究是走在前列的一个大型Ⅲ期临床研究，首次尝试了PDL1单抗与抗血管生成治疗的联合[32]。在该研究中，B组的患者使用了阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗联合含铂双药化疗的方案。结果发现，与C组(贝伐珠单抗联合化疗组)相比，B组更好的改善了晚期初治非小细胞吧肺癌患者的PFS和OS。之后，国内外又相继开展了多项PD1/PDL1单抗联合抗血管生成治疗的临床研究。JVDF研究是使用雷莫芦单抗联合帕姆单抗治疗晚期初治非小细胞肺癌的Ⅰ期临床研究，在2019年世界肺癌大会(WCLC)上报道了初步结果。该研究结果显示，PDL1表达在1%～49%的人群，客观缓解率(objective response rate, ORR)达到 22.2%；在PDL1≥50%的人群中，ORR达到 56.3%。另一项信迪利单抗联合安罗替尼一线治疗晚期NSCLC的Ⅰ期临床研究显示，总入组的22例患者中，16例患者达到部分缓解，总人群的 ORR达到72.7%(49.8%，89.3%)，DCR为100%(84.6%，100%)[33]。

4.2.4免疫联合免疫治疗免疫联合免疫治疗策略是为了更好的促进T细胞的活化效应或逆转T细胞耗竭，从而加强免疫治疗的效果。伊匹木单抗是靶向作用在CTLA4分子上的免疫检查点抑制剂。CTLA4分子常表达在T细胞表面。在抗原递呈阶段，抗原递呈细胞上的共刺激分子B7与T细胞表面的CD28结合，与TCR-抗原-MHC分子复合物共同启动T细胞活化。但CTLA4分子可拮抗性竞争B7分子，抑制T细胞的活化。CTLA4抑制剂可阻断负性信号，正向促进活化过程。Checkmate227研究探讨了伊匹木单抗联合纳武利尤单抗治疗初治晚期非小细胞肺癌的疗效，在2019年ESMO上汇报了Part1组的OS结果[34]。伊匹木单抗联合纳武利尤单抗组OS达到17.1个月，显著好于单纯化疗组。2020年AACR大会报道了ARCTIC研究的Part B研究结果[35]，Part B探讨了度伐利尤单抗联合Tremelimumab治疗复发晚期PDL1表达≤25%的非小细胞肺癌，联合治疗组的OS显著好于标准化疗组。

T细胞表面除了表达PD1以外，还会表达其它多种免疫负性调控作用的分子，如Lag-3、Tim-3以及TIGIT分子[36]。抗PD1/PDL1单抗联合这类分子抑制剂的临床研究正在进行中。

5 结 语

免疫治疗的耐药问题已经越来越被重视。了解免疫耐药的机制是预防耐药和克服耐药的前提。克服耐药一方面需要在治疗前了解患者的基线微环境状态，另一方面需要在治疗过程中实时动态检测TME的分子改变。分子及基因监测是重要的手段。患者的突变负荷状态、驱动基因突变情况、多种相关基因的表达情况，以及微环境中CD8+T细胞浸润的情况、PD-L1表达情况、T细胞克隆类型等[4]，均可以为耐药提供有价值的信息。联合治疗可以扩大免疫疗效及改变免疫治疗结局。精准的联合治疗必须建立在精准检测以及多种针对性药物可及的前提下。联合的模式需要考虑1+1>2的方案，而不仅是简单的排列组合。免疫治疗前景光明美好，但还有太多的未知需要不断探索。