吲哚及衍生物靶向T细胞调控中枢神经系统的研究进展

胡晓敏综述，王文春，张安仁审校

0 引 言

肠-脑轴是通过中枢神经系统(central nervous system，CNS)、自主神经系统、肠神经系统及内分泌系统双向沟通大脑与肠道的轴线，这一轴线任何环节出现差错都将导致大脑和肠道功能紊乱。近年来，肠道菌群(gut microbiota，GM)作为新成员加入了肠脑轴，构成菌群-肠-脑轴。肠道微生物群是人体最庞大的微生态系统，据估计肠道中存在1013～1014种微生物[1]，对宿主多种生理功能具有重要意义，包括免疫发育、代谢和营养稳态等。越来越多的证据表明GM直接参与神经精神疾病的发生，其作用机制十分复杂，但正在被研究人员逐步阐明，它们包括神经、免疫、内分泌和代谢等多种途径。在CNS中，最受关注的GM代谢物是膳食纤维衍生的短链脂肪酸，该代谢物已在认知、情绪、食欲及神经炎症等方面取得巨大突破[2]。而最近有研究表明，GM代谢色氨酸(tryptophan，Trp)产生的吲哚及衍生物可抑制神经炎性和神经毒性，改善多发性硬化(multiple sclerosis，MS)的疾病症状[3]。此外免疫系统作为沟通菌群-肠-脑轴的桥梁，担负着主调节器的作用，尤其以T淋巴细胞为代表的适应性免疫是菌群-肠-脑轴双向沟通的重要组成部分[4]。

目前已知T细胞在CNS的炎症和免疫反应调节中具有重要地位，且T细胞与MS的发生发展密不可分，同时有研究表明菌群代谢的吲哚及其衍生物对神经炎症具有调控作用。本文将回顾国内外研究，探讨吲哚等代谢物是否可以通过调节T细胞的分化从而影响CNS炎症和免疫反应。

1 吲哚及吲哚衍生物的来源

吲哚是一种吡咯与苯并联的有机芳香族化合物，可由GM代谢Trp产生。部分GM通过表达色氨酸酶将Trp转化为吲哚、丙酮酸和氨[5]。目前大约有80多种革兰阳性菌和革兰阴性菌都能表达色氨酸酶以产生吲哚，其中包括多种致病菌，如阿尔维杆菌、致病性大肠埃希菌、志贺氏菌、粪肠球菌和霍乱弧菌等[6]，该酶可被Trp诱导表达，且在许多肠道专性厌氧菌中受到葡萄糖分解代谢的抑制[7]。

细菌代谢产物吲哚可在肝中转化为吲哚酚硫酸盐(indoxyl sulfate，IS)，IS是一种尿毒症毒素，与慢性肾病(chronic kidney disease，CKD)患者的肾功能呈负相关[8]，且与CKD后心血管疾病的发生显著相关[9]。而IS在无菌小鼠体内未检测到，此外吲哚丙酸(indolepropionic acid,IPA)的产生也同样取决于GM的存在，并依赖于产孢梭菌[5]。但是，近年有研究发现产孢梭菌并不是唯一能产生IPA的肠道细菌[10]，在其他厌氧(如肉毒杆菌、消化链球菌CC14N等)中也发现了与产孢梭菌相似的编码IPA产生的基因簇—苯乳酸脱水酶基因簇，其同源物的存在是产IPA细菌的可靠标志。同时，有研究表明消化链球菌能代谢Trp产生IPA和吲哚丙烯酸(indoleacrylic acid,IA)[11]。而在对26株人结肠优势苯代谢物形成菌的鉴定研究中发现，其中5种拟杆菌和两种硬杆菌在产生大量多环芳烃和4-羟基多环芳烃的同时也产生了吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)[12]。

吲哚及其衍生物可通过细胞膜蛋白转运或直接扩散至血液、外周组织和大脑中，在人体中发挥一些生物学作用[6]。研究表明吲哚及其衍生物通过限制LPS等有毒物质渗漏、减轻炎性浸润、增强病原菌抗性、改善胰岛素抵抗、抑制氧化应激等方式，在肠道疾病、代谢性疾病、肝疾病及中枢神经系统疾病中发挥重要作用[13-15]。目前多数代谢物的具体信号传导通路仍在持续探索，但研究多处于动物实验阶段，临床转化需进一步研究，而吲哚等如何保护CNS已取得重要进展。

2 吲哚对CNS的调控作用

GM代谢Trp产生的吲哚及其衍生物在CNS自身免疫性炎性疾病中的作用已有报道，其通过调节CNS免疫反应及神经炎症对疾病进展发挥作用。小胶质细胞和星形胶质细胞作为CNS的重要细胞群体，与神经炎症和多种神经退行性疾病相关，在疾病中的影响也是复杂的，对宿主可能既有害又有益。最近Rothhammer等[3]发现吲哚、IS等通过激活芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor, AHR)调节小胶质细胞活化及转化生长因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)和血管内皮生长因子-β(vascular endothelial growth factor-β，VEGF-β)的产生，进而调节星形胶质细胞的促炎和神经毒性作用，最终调控CNS炎症；此外，吲哚、IPA等可直接作用于星形胶质细胞，通过与I型干扰素(type I interferon,IFN-I)联合作用激活AHR信号以控制神经炎症[16]。该研究表明缺乏膳食Trp会使实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠的临床评分恶化，而Sonner等[17]发现饮食Trp限制对MS小鼠具有保护作用,两者结果的差异可能与喂食无Trp饮食的时间不一致有关，但目前尚无定论。

多项研究发现人体肠道共生菌通过调节系统性免疫反应以改善小鼠神经炎症和脱髓鞘相关疾病(如Prevotella histicola、大肠埃希菌Nissle 1917和产气荚膜梭菌)，主要与系统反应性T细胞的炎症因子分泌减少、调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)产生的抑炎因子增加和巨噬细胞的抑制相关[18-20]。此外有研究表明，EAE小鼠中，髓鞘特异性辅助性T细胞17(T helper cell 17, Th17)的肠道浸润比神经炎症更早出现，并改变了GM组成，使用维多珠单抗抑制致脑炎性Th17细胞的肠道归巢可缓解EAE[21]。上述研究充分证实了T细胞在菌群-肠-脑轴中的关键作用，特别是在CNS炎症方面，那么作为菌群代谢物的吲哚及其衍生物是否参与其中，并且以何种机制融入此轴线有待进一步探究。

3 CNS内T细胞的激活

3.1 T细胞的活化T细胞是中枢神经系统免疫监视必不可少的，但是，它们也可以在病毒感染或自身免疫等情况下诱发严重的病变。因此了解T细胞在CNS疾病中的活化机制，对预防和治疗CNS疾病至关重要。Louveau等[22]在EAE小鼠中发现，减少神经炎性条件下的淋巴引流可致使脑炎性抗原特异性T细胞降低，证明了脑膜淋巴管控制CNS的炎症过程和免疫监视。随着硬脑膜淋巴管的发现，打破了长期以来对大脑免疫特权的认知，也表明了CNS与外周免疫系统之间存在必然联系[23-24]。CNS的T细胞活化可能存在两种方式。第一种，由CNS内的抗原引起的T细胞活化。在CNS表达的自身抗原或外源抗原与抗原提呈细胞(antigen-presenting cells，APC)相互作用后，可在脑引流淋巴结中引起抗原特异性T细胞的产生，随后再归巢至CNS以消除外来抗原或引起自身免疫性炎症。第二种，由非CNS抗原引起的T细胞活化，这些抗原可以是CNS抗原的分子模拟物或源自外周的病毒。由外周免疫区室衍生的抗原激活全身性T细胞反应，而后致脑炎性T细胞迁移到CNS，目前这种“异常”归巢至CNS的机制尚未明确[25-26]。T细胞渗入CNS的通道主要是蛛网膜下腔血管、毛细血管后小静脉或脉络丛，而不同的T细胞亚群可能会通过不同的解剖途径进入CNS。并且，它们穿越脑屏障的能力可能存在差异，研究表明T细胞穿过血-脑脊液屏障进入CNS比穿过血脑屏障更困难[27]。此外，APC对于T细胞的活化和增殖是必需的，CNS内的APC可能包括脑膜、血管周和脉络丛的巨噬细胞、树突状细胞、B细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞等，其中树突状细胞和巨噬细胞被科研人员广泛关注，其他细胞的功能还存在争议，有待进一步确定[25]。EAE小鼠和MS患者的免疫学研究表明，靶向CNS的外周免疫反应在早期阶段驱动疾病进程，而CNS内的免疫反应则主导了进展阶段[28]。

3.2T细胞的分化T细胞在CNS中激活后，分化为功能不同的T细胞亚群，在CNS疾病中发挥重要作用。长期以来针对MS动物模型即EAE小鼠的免疫学研究表明，髓磷脂特异性CD4+T细胞在外周淋巴组织中被激活，并分化为致脑炎性细胞—辅助性T细胞1(T helper cell 1, Th1)和Th17[29]。它们穿过BBB后进入CNS实质，导致BBB破坏、少突胶质细胞丢失、脱髓鞘及神经炎症[30]。在EAE的CNS中Th1细胞是最常见的Th细胞亚群，主要分泌促炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α。IFN-γ是其标志性细胞因子，可使少突胶质细胞死亡并导致神经元脱髓鞘，且IFN-γ的水平与疾病活动性频率相关[31]。另有研究发现IFN-γ能稳定BBB的内皮细胞并增加其紧密连接蛋白的表达，表明IFN-γ在促炎的同时对EAE期间的神经炎症具有抑制作用[32]，此外IFN-γ也与社交行为和记忆功能等有关[33]。 Th17细胞被证实在CNS自身免疫中占据核心地位，其分泌白细胞介素17(interleukin 17, IL-17)、IL-21和IL-22，由于IL-17受体的广泛表达，Th17细胞具有引起炎性组织损伤的巨大潜力[26]。一直以来，分泌IFN-γ和IL-17的CD4+T细胞被认为是引起MS的病因学说之一。最近，在MS患者和EAE小鼠中发现一种Th1样Th17细胞，可同时表达IFN-γ和IL-17，与传统Th17细胞相比，这些细胞产生的IL-17较少而IFN-γ较多，并且这些细胞因子几乎完全来源于由IL-23驱动的ex-Th17细胞[34]。Th1样Th17细胞的致脑炎性作用还未阐明，可能具有Th1和Th17细胞的双重效应。在炎症最严重的时候，效应T细胞可以被重新编程以表达IL-10，而这些“ex-Th1”和“ex-Th17”细胞可以成为“1型调节性T细胞(type 1 regulatory T cell,Tr1)样”细胞，有助于炎症的消退。表达叉头样转录因子3(Forkhead Box Protein 3，FOXP3)的Tregs分泌免疫抑制细胞因子IL-10 和TGF-β，可抵消过度旺盛的免疫反应而抑制继发性炎症,减轻组织损伤，并通过分泌肾母细胞瘤过度表达蛋白(nephroblastoma overexpressed,NOV/CCN3)促进少胶质细胞分化和髓鞘再生[35]，此外Tregs的耗竭增加了急性颅脑损伤小鼠中T细胞的脑浸润、反应性星形胶质细胞增生及IFN-γ的基因表达[36]。充分证实Tregs通过抑制自身免疫反应和炎症以保护组织完整性，促进CNS组织修复，其对维持CNS的稳态至关重要。

综上可知，T细胞激活后分化为不同功能的亚群，在CNS内调控免疫反应，分泌的细胞因子在神经炎症过程中发挥独特的作用。近年来靶向T细胞的免疫疗法蓬勃发展，如IFN-1、纳他珠单抗和芬戈莫德等，多数已获相关机构批准，但这类免疫疗法存在多种副作用，治疗时需依据风险和益处选择使用，因此针对自身免疫性炎性疾病研发有效且副作用少的T细胞靶向疗法是必要的。

4 吲哚及衍生物靶向T细胞调节CNS的可能性

4.1 AHR调控T细胞的分化在人体内，AHR在免疫系统中广泛表达，不同的T细胞亚群表达的AHR存在差异，其中Th17表达的AHR水平最高，Tregs其次，而在单纯CD4+T细胞、Th1和Th2中检测不出[37]。AHR通过不同信号转导途径调控T细胞的发育分化和功能极化，在先天和适应性免疫过程中发挥重要作用。

已知Th17在不同细胞因子驱动下可能分化为致病性Th17细胞，也可能分化为非致病性抗炎性Th17细胞，而AHR可在多个水平上影响Th17细胞。在Th17的发育过程中AHR的表达上调，并能促进IL-17A、IL-17F和IL-22的产生，但是在由TGF-β3和IL-6诱导分化的致病性Th17细胞中AHR的表达减少。研究表明IL-2可干扰Th17的分化，尤其在早期阶段。AHR被证明可以同信号传导与转录激活因子3(signal Transducer and Activator of Transcription3,STAT3)相互作用以诱导Aiolos，其为锌指蛋白Ikaros家族成员之一，主要在淋巴细胞中表达，而Aiolos能抑制IL-2的表达，以消除IL-2在Th17分化早期的抑制作用。此外，AHR限制STAT1和STAT5的信号传导，进而干扰Th17细胞的分化。同时，AHR还能介导Th17细胞转为产IL-10的抗炎Tr1细胞。Quintana等[38-39]认为AHR可能在Th17细胞分化的不同阶段发挥不同的作用。在早期阶段，AHR可能限制IL-2的抑制作用并促进IL-10的产生，而在晚期阶段，它可能有助于IL-21和 IL-22的表达。总而言之，AHR可促进Th17细胞的分化，但是这种分化指向致病性还是非致病性尚待确定。

AHR同样能影响Treg细胞，它可直接诱导FoxP3的表达并控制其表观遗传状态，使其更容易转录。FoxP3通过促进靶基因的表达和抑制与效应T细胞应答相关的基因(如Aiolos)表达来促进Treg细胞的分化。此外，AHR对STAT1活化的限制，同样能抑制表达FoxP3的Tregs(FoxP3[+]Tregs)细胞的分化。另一种不表达FoxP3的Tr1细胞，其特征在于IL-10的表达，但这种细胞因子亦可由其他细胞亚群产生，而Tr1细胞的特异性细胞因子目前尚未鉴定出，其谱系朔源也不清楚。研究表明IL-27诱导的AHR与c-Maf相互作用并协同激活人、小鼠IL-10和IL-21基因启动子，增加Tr1细胞的产生且改善EAE，然而AHR的缺乏可使TGF-β和IL-27诱导的Tr1细胞产生[39-40]。此外研究表明AHR可以控制Tr1细胞的代谢过程，并通过促进缺氧诱导因子-1α的降解进而增加Tr1细胞的分化[41]。

此前有研究表明，AHR对T细胞的调节作用是配体特异性的，但是也有研究认为配体的应用方式似乎比其本身更具决定性作用，如给药时间和给药途径，还需更多研究来阐述不同配体对AHR激活及其对不同免疫细胞的影响[42]。AHR的配体四氯二苯-p-二恶英(tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)可激活AHR诱导的FoxP3[+]Tregs细胞分化，且以TGF-β1依赖性方式抑制EAE；而6-甲酰基吲哚并[3,2-B]咔唑(6-Formylindolo[3,2-b]carbazole,FICZ)可干扰Tregs细胞的分化，并通过促进Th17分化加剧EAE[43]。在斑马鱼中也得出了同样的结果，TCDD可激活AHR抑制炎症和IL-17的表达[44]。色氨酸降解的犬尿氨酸途径代谢物最近已被证明可作为AHR配体使其活化并增强Tregs细胞分化[45]。

4.2吲哚及其衍生物激活AHR靶向T细胞调节CNS炎症和免疫反应已知吲哚及其衍生物以AHR依赖性方式调节星形胶质细胞和小胶质细胞的神经炎性和神经毒性作用，进而改善CNS疾病进程。在自身免疫性脑炎中，星形胶质细胞和小胶质细胞首先可以促进T细胞浸润及募集更有效的APC，而后当T细胞进入CNS时就可获得抗原呈递表型，发挥APC作用[25]，那么吲哚等可能通过激活AHR调节CNS固有细胞进而影响T细胞的活化和分化。此外AHR可通过多种机制调控T细胞分化为Th17和Treg细胞，进而对炎症和免疫反应产生不可忽视的影响，且不同的配体或激动剂活化AHR后对不同细胞亚群的作用存在区别，但这些区别对疾病走向的引导作用还不够明确。而作为AHR配体或激动剂的菌群代谢物吲哚等在维持肠屏障功能、调节肠道稳态、抵抗病原菌感染及抑制全身性炎症等方面已被证实具有重要作用。此外，有研究表明罗伊氏乳杆菌代谢Trp产生的吲哚等可激活肠上皮内CD4+T细胞中的AHR，使CD4+T细胞重新编程为免疫调节性T细胞[46]。因此，我们可以猜想吲哚及其衍生物穿过BBB激活CNS内的AHR，进而调控渗入T细胞的分化，但这种调控作用是正向或负向还需研究验证。综上可知，菌群代谢Trp产生的吲哚及衍生物通过激活AHR调节星形胶质细胞和小胶质细胞的活化而促进T细胞分化，或者AHR直接调节转录因子影响T细胞分化，但是吲哚等对T细胞的调控作用会使宿主病理生理向何处发展还需探索。

5 结 语

由于人类与小鼠的AHR激活和传导途径不完全相同，可能造成研究结果的差异性。研究表明，人类和小鼠的AHR在肝细胞中调节基因表达时具有差异性，因此推测AHR引起的基因调控的差异性也可能发生在其他细胞中[40]。另外，小鼠和人体内的AHR信号分子对配体或激动剂的亲和力不同，人体内AHR结合内源性吲哚衍生物，如靛玉红、吲哚和吲哚硫酸盐，其亲和力远高于小鼠体内的AHR，而外源性AHR配体[如TCDD和苯并(a)芘]通常与小鼠体内AHR结合的亲和力更高[4]。此外在不同免疫细胞中表达的AHR的亲和力是否存在差异，以及这种亲和力的差异对疾病带来的影响，目前都尚未阐明。因此，使用人源化小鼠了解不同的环境下各种AHR配体在不同细胞间的作用对靶向AHR途径的治疗至关重要。

此外，菌群介导的Trp代谢物具有全身作用，故疾病的靶向治疗途径也是当前的热门问题。吲哚等对机体除了有益作用外，还会产生一些毒副作用，如产生IS，故如何在拥有良好的治疗效果下尽可能规避这些负面影响是未来研究需要思考的问题。与此同时，饮食、压力、年龄、药物等外部因素对肠道菌群及吲哚等的影响尚不清楚，这些因素在吲哚对疾病发挥调节作用时是否参与也不清楚。

而T细胞在CNS免疫和炎症反应中无疑是举足轻重的角色，靶向T细胞治疗CNS疾病是一个重要思路，目前已获批准的免疫疗法均有多种副作用，故寻找有效且副作用少的T细胞靶向疗法是必要的。菌群代谢物吲哚及衍生物给我们带来了新的启示，因此对于菌群、吲哚及AHR与T细胞的联合作用还有待于深入研究，进一步扩展我们对CNS疾病病理生理的理解。