兔膝骨性关节炎模型建立的现状

何小华，郑晓霞，黄艳妮，程艳玲

(山东省药学科学院，济南 250101)

骨性关节炎是临床常见的一种退行性骨关节病变，系由于增龄、肥胖、慢性劳损、创伤、关节先天异常等因素引起，其主要病变为关节软骨破坏、退化损伤、关节边缘和软骨下骨质增生，好发于膝关节，以中老年人群多见，又称退行性关节炎或老年性关节炎[1]。临床表现以缓慢发展的关节疼痛、肿胀、压痛、僵硬、关节活动功能障碍为主，严重者出现关节畸形[2]。骨性关节炎发病机制非常复杂，病因尚不明确，目前临床主要以预防和对症治疗为主，没有良好的治疗措施[3-4]。通常采用动物模型(鼠、犬、兔、羊等)探索膝骨性关节炎的发病机制和防治方法。由于建立骨性关节炎模型形成的原因及发病机制不同,最终引起关节产生的病理变化程度不一致，因此理想的动物模型既要符合发病机制和特点，又要满足特定的研究需要。基于兔的膝关节大，负重大，与人相近，且脾气温顺有利于开展实验操作，故选择兔建立稳定、可靠、有效的关节炎动物模型是研究骨关节炎发病机制及防治的重要手段[5]。现就兔膝骨性关节炎建模情况进行综述，以为不同研究目的选择不同的建模方法提供参考。

1 自发性模型

自发性模型，即实验动物在自然环境情况下自发产生病变，没有经过任何人为设立因素处理或因基因突变形成的骨性关节炎动物模型，经过育种、繁衍使基因遗传保留下来的模型，如C57黑鼠等[6]。研究发现,以高脂饲料喂养C57BL小鼠可缩短其关节退变时间，尤其是喂养动物性油脂饲料，其骨性关节炎发生率更高[7]。高浜显泓和山本吉藏[8]动态观察模型发现，60%的小鼠6个月出现Ⅰ度骨性关节炎表现，18个月全部小鼠出现Ⅰ度骨性关节炎变性，仅有18%出现Ⅱ度，9%出现Ⅲ度骨关节炎表现。由于不受其他因素的影响，因此可以排除因造模差异产生的误差。采用自发性动物模型可以了解骨性关节炎的全过程，适合于发病机制及各种防治效果的比较研究，但采用此方法建立兔膝骨关节炎模型的文献报道极为少见。

2 诱发性模型

2.1骨内高压诱导法 骨内高压膝骨性关节炎模型利用阻断动物下肢主要静脉的血液回流，造成膝关节周围骨组织内压力持续升高[9]。刘蜀彬等[10]通过阻断20只大耳白兔的膝关节股骨干骺端髓内局部血液循环，发现股骨关节面上软骨在术后16周出现明显的退行性改变。张如明[11]将兔髂外静脉和股静脉结扎，阻断髌骨回流静脉后保留膝关节自由活动，术后30 d髌骨远近端表面有编织状骨形成，60 d股四头肌腱和髌腱细胞转化为软骨细胞，90 d形成软骨灶，出现典型髌骨关节骨性关节炎的表现，但未发现严重的骨性关节炎病变，可能原因为造模时间短。戴七一等[12]采用结扎割断新西兰兔右侧臀部的臀下静脉、股静脉及大隐静脉来阻断血运，升高骨关节骨内高压，术后第8周发现早中期膝关节骨性关节炎模型形成。吴并生等[13]采用结扎股静脉保留股深静脉向髂外静脉回流的通路保持动静脉存在一定的压力差，打乱骨组织的血流动力学引起骨内压升高，最终形成局部软骨及骨组织病变，也可建立骨性关节模型。当阻断膝关节局部血运时，股内外静脉淤血引起关节周围骨内高压、组织缺氧，产生大量酸性代谢产物，关节滑液pH值下降，从而导致软骨营养供应受限，加速软骨的退行性改变，因此骨内压和静脉淤积在骨性关节炎发病过程中不可缺少，但并不是骨性关节炎的起始原因[14]。

阻遏关节局部血液循环可诱导骨内高压产生，有效避免了手术的创伤及术后炎症反应的影响，是筛选骨关节炎药物防治和早期病理变化的良好模型，但造模时间周期长，造模成功率低，不适宜慢性损伤导致的骨关节炎发病机制的探讨[15]。

2.2手术诱导法 由各种原因导致关节的稳定性发生改变，不稳定的关节在长期的活动中造成关节的退行性改变是产生骨性关节炎的发病原因之一。因此，通过切断或破坏关节结构及其附属结构造成关节不稳可建立理想的动物骨关节炎模型。

2.2.1内侧副韧带和(或)髌韧带切除 膝内侧副韧带和(或)髌韧带具有稳定和运动膝关节的作用。多种原因导致膝内侧副韧带和(或)髌韧带的损伤均可影响膝关节功能的稳定性，从而导致关节炎的发生。朱鸿飞等[16]将16只新西兰大白兔切断双后肢膝内侧髌韧带2/3建模，术后1周每天强迫活动1 h，结果显示术后6周、8周均出现关节软骨细胞退行性改变及滑膜增生等，6周表现为膝关节炎早期改变，8周表现为膝关节炎中期改变。汪青春等[17]切除兔后肢髌韧带3～4 mm发现,其可导致不同程度的膝骨性关节炎发生。杨松滨等[18]采用切断兔内侧副韧带并切除部分髌韧带建模，术后4、8周关节软骨均有不同程度退变，此方法造成的软骨破坏和滑液炎症及修复过程与自然发生的骨性关节炎类似，但8周Mankin评分和白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α水平明显升高，表明切断内侧副韧带并切除部分髌韧带的方法可以建立比较理想的兔膝骨性关节炎模型。

2.2.2前交叉韧带和(或)半月板切除 关节不稳是导致骨性关节炎发生的原因之一，即通过改变关节结构导致关节应力发生变化，从而使局部受力不均会造成关节的退行性改变。江捍平和王大平[6]通过剪断犬膝关节前交叉韧带建模，观察到膝关节炎发生过程与自然发生(前交叉韧带破裂引起)类似，且病理改变相同。朱长谋等[19]将8只兔剪断一侧前交叉韧带，摘除内侧半月板，术后8周可复制骨性关节炎。Moskowitz等[20]采取从兔膝关节内侧打开关节腔，将关节内半月板部分切除，以减少关节运动的缓冲作用，增加关节面的摩擦，造成关节不稳，从而建立稳定的骨关节炎模型。杨瑞甫等[21]从兔膝关节内侧剪开部分关节囊，将兔膝关节前交叉韧带完全切断，避免损伤关节软骨及后交叉韧带，在术后6周出现软骨中度损伤的表现，可获得类似骨关节炎早期或中期病变，适合发病机制、药物治疗等方面的研究。

2.2.3Hulth模型 Hulth模型为最常用的经典模型，但其手术操作复杂，对实验者技术、解剖结构熟悉程度要求较高，手术易损伤软骨，影响实验结果，造模后动物感染和死亡率较高，不适合早中期软骨损伤的探讨。造模的具体步骤是在无菌条件下从膝关节内侧打开关节腔，切断前后交叉韧带，内侧副韧带及全部内侧半月板，但保留关节软骨面，术后不固定，自由活动。方锐等[22]在兔膝关节行Hulth法造模，术后4周可出现膝骨性关节炎的病理改变。苏达明等[23]采用经典的Hulth法建立动物模型，术后第6周X线提示兔膝骨性关节炎造模成功。王君等[24]将兔右侧膝关节前交叉韧带切断建立前交叉韧带剪断模型，3 d后将左腿石膏固定于腹部，右腿负重训练，4周后发现兔膝关节负重模型可加快关节退行性改变，减少前交叉韧带剪断造模所需时间。这两种方法均造成关节软骨和软骨下骨破坏，骨质增生，骨小梁紊乱，造模成功率高,具有一定的代表性，但前者关节软骨易破坏且易出血、感染风险大，后者对预防或减轻骨关节炎发生发展的药物研究尤为适用。

2.2.4关节应力改变诱导模型 骨关节面承受不同的应力均可导致关节面软骨不同程度的退行性改变。低应力最早可引起早期软骨细胞功能衰退，软骨细胞出现轻度增生，最终出现关节软骨破坏，骨质增生等退行性改变；高应力起初引起软骨基质早期损伤，同时出现软骨细胞代偿性增生，软骨破坏，从而导致关节软骨退行性改变，其中在软骨退行性改变中细胞因子发挥重要作用[25]。王胜等[26]通过延长兔髌韧带3 mm，减少骨关节应力而造成髌骨软骨退变，术后16周发现软骨层变薄，出现纵行裂纹，细胞排列紊乱，软骨下组织明显疏松，表明降低关节软骨压力是引起退变的原因之一。陈宝兴和丁继华[27]将1周内的Wistar种大鼠结扎双前肢和尾部，增加双后肢关节应力，3、6个月分别处死剖检，发现后肢股骨头软骨基质内假性囊肿形成，软骨下骨出现退行性改变，此法可建立最理想的骨关节炎模型。可见，提高关节应力是引起关节病变的原因。

2.2.5软骨划痕诱导法 采用膝关节软骨损伤建立动物模骨关节炎型能观察膝关节退行性改变的演变和修复过程。利用锐器在关节股骨负重区软骨上划痕，深度不伤及软骨下层，可以避免关节不稳定及滑膜炎症影响关节软骨保护和修复的治疗效果观察，但兔膝关节内划痕极易造成滑膜损伤[28]。李钊等[29]采用小针刀在兔胫骨平台和股骨髁软骨表面上划4～5道痕，深度不超过软骨层，避免半月板和滑膜损伤，术后2 d开始活动，每天半小时，5周后发现关节软骨出现退行性改变及骨关节炎的典型病理改变。Marijnissen等[30-31]采用刀片在犬膝关节股骨髁上划伤，深度至软骨，不超过软骨下骨，术后对侧肢体固定进行强迫运动，每周3 d，每日4 h，共20周。结果显示，20周和40周(后20周松解对侧肢体固定)后，发现关节软骨的生化改变与临床相同，但膝关节炎临床症状轻微。因此，软骨划痕诱导法适用于关节炎早期软骨保护和修复的治疗措施效果的探索研究[32]，此法要求实验技术人员对动物膝关节局部解剖结构非常清晰，操作手法需非常娴熟，但手术划伤深度掌控比较困难，因此造模成功率不高，未被广泛推荐应用。

手术诱导法建模时间短，稳固性强，目前应用最常见的包括前交叉韧带剪断、半月板切除、内侧副韧带剪断以及Hulth法、直立负重法等，但由于手术损伤大，易造成滑膜、软骨的损失，切口感染、关节腔积液、关节肿胀，影响关节生化代谢和关节宽度测量指标的准确性，有的甚至死亡，因此不适合骨关节炎生化代谢药物影响的探讨[15]。然而，单纯剪断前叉韧带并石膏固定1周，1周后强迫训练，可有效避免手术操作造成的影响，同时也避免了长时间关节制动诱导造模的不利因素，适用于探讨骨关节炎早中期病理改变及中医药疗法的作用机制。

2.3腔内药物注射诱导法 腔内药物注射诱导法虽然创伤小，但要求操作者关节腔注射技术极为娴熟，避免血管损伤及药物注射造成实验效果的误差，而且腔内注射的药物还直接影响关节生化代谢，不适用于需要测定生化指标的研究，主要用于软骨病理及关节炎药物预防和治疗的研究。

2.3.1木瓜蛋白酶 木瓜蛋白酶属于巯基蛋白酶，又称木瓜孝素。其作用机制是降解软骨内蛋白多糖和软骨细胞膜上有丝分裂抑制因子，从而破坏软骨蛋白水结合功能[33]。采用关节腔内注射木瓜蛋白酶模型的特点为软骨退变快、模型可重复性好、稳定、造模时间短等，该模型骨性关节炎病变与人类骨性关节炎相同[34-36]。该模型适用于软骨晚期病理、外用药物治疗及方法疗效的研究[37]。韩冠英等[38]分别在第 1、3、5 天将不同浓度的木瓜蛋白酶(2%、5%、10%)注射入兔膝关节腔，首次注射后第2、4、6周出现膝骨性关节炎退行性改变，程度随木瓜蛋白酶浓度升高而增加，随着时间延长而发展。

2.3.2胶原酶 胶原酶是一种分解细胞间质的金属蛋白酶。Kikuchi等[39]在兔膝关节腔内注射胶原酶，6周后，软骨和滑膜出现退行性病理改变，膝关节上下关节面股骨髁和胫骨平台边缘病变尤为突出，且随着时间延长，剂量增加，病变逐渐进展，与人类膝骨性关节炎表现极为相近。该实验可在短时间内诱导骨关节炎症反应，促进软管退变，且所需剂量较木瓜蛋白酶低，造模较木瓜蛋白酶诱导更容易，是一种方便简捷的造模方法，适用于骨性关节炎病理及治疗骨关节炎药物疗效的研究。

2.3.3雌二醇 临床上，膝骨性关节炎好发于肥胖绝经后女性，且雌激素分泌较多，提示雌激素与骨性关节炎发病有关。在实验中发现关节腔内注射雌二醇可造成关节软骨损伤，在兔的关节软骨细胞内存在雌二醇受体，也说明雌二醇与骨性关节炎发生有关。Tsai和Liu[40]采用雌二醇注入兔膝关节腔，兔股骨髁关节软骨9周后，表面变薄，软骨面开裂，出现纤维化；12周侵袭破坏到软骨钙化层，股骨外露，电镜显示软骨细胞不同程度的变形，细胞核凹陷，出现腔隙陷窝及囊泡，证实雌二醇与骨关节炎有关。

2.3.4菲律宾素 菲律宾素是一种从微生物中提取的抗生素，能破坏滑液中溶酶体，将其注入兔膝关节腔内，可诱导滑膜增生、基质破坏、关节周围骨质增生、软骨细胞破坏等退行性改变的发生，诱发膝骨性关节炎产生[41]。石辉等[42]用尿激酶型纤溶酶原激活物0.4 μg/0.2 mL注射关节腔，12周后可成功制备骨性关节炎模型。此外，肾上腺皮质激素、透明质酸酶、软骨碎片、单体碘乙酸、异物等膝关节腔内注入也可以诱导膝关节软骨的退行性病理改变[17，43-44]。刘伯龄和刘献祥[45]研究认为，采用木瓜蛋白酶、胶原酶、雌二醇、聚乙烯亚胺等药物关节腔内注射造模，因药物分子量、剂量、注射时间不同引起关节软骨退行性改变的程度不同。

2.4关节制动诱导法 长期固定动物后肢膝关节一段时间后可减少关节活动，改变关节应力，出现关节软骨萎缩等退行性改变[17]。目前关节制动体位主要有伸直位、屈曲位和中间位等[3]。有研究将家兔膝关节固定30 d，关节软骨表面有圆形凸起，但未完全破坏，而固定60 d后，关节软骨退变不可逆转[46-47]。Okazaki等[48]将家兔右后膝关节固定伸直位2周后，关节软骨可见早期退行性改变，4周后可见中期退行性改变，6周后可见严重不可逆转的退行性改变。关节制动诱导法可避免因手术引起滑膜损伤而影响模型的效果，更符合骨关节炎慢性损伤的病理演变，在研究关节炎药物疗效及药物筛选方面具有明显优势，同时对关节软骨成分及炎症介质表达等具有重要意义[15]，但其固定松紧度不易掌握(松：没有效果；紧：下肢出现淤血水肿、坏死、固定部位周围皮肤磨损等)，造模周期长且长时间固定，下肢血液循环受阻，易导致踝关节和足周围肿胀、溃破，出现坏死或感染，甚至出现新西兰大白兔自噬下肢，严重者因下肢坏疽而死亡。

3 小 结

骨性关节炎是国内外专家学者研究的一个热点，而有效建立合适稳定的动物模型，是研究骨关节炎发病机制、病理改变及防治的重要方法。因此，探索建立骨关节炎动物模型可为其防治提供一个良好的实验基础。目前建立兔骨关节炎模型主要采用关节骨内高压诱导、关节内手术诱导、关节腔内药物注射诱导、关节制动诱导、软骨划痕诱导等方法，各种诱导方法均有利弊，不同的实验根据研究需要选择适宜的建模方法，为顺利完成动物实验提供一定的参考依据。