维生素C与顺铂联合用药对人乳腺癌细胞MCF-7的杀伤作用及机制研究

祝连明，黄楠，孙爱华

(1.浙江大学医学院附属儿童医院药剂科，杭州 310003； 2.浙江中医药大学医学技术学院，杭州 310053；3.杭州医学院基础医学与法医学院，杭州 310053)

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，由于乳腺癌细胞连接松散，脱落后容易随血液和淋巴液转移，所以乳腺癌的一大特点为早期转移[1-3]。维生素C是人体必需的维生素之一，人体不能自身合成，只能从体外摄取，其在维持机体的功能和物质代谢调节中起重要作用[4]。临床上常将维生素C作为辅助性药物，目前化疗时也使用维生素C，但剂量一般较小。有学者认为，维生素C通过影响物质代谢和能量代谢达到抗肿瘤作用，但其抗肿瘤效果一直存在争议[5-6]。近年有研究认为，静脉注射大剂量的维生素C(每日10 g)对肿瘤治疗有效[7-8]。顺铂是一种广谱抗肿瘤药物，作为细胞周期非特异性药物通过激活DNA损伤杀死细胞。目前，顺铂广泛应用于膀胱癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多种实体瘤的治疗[9-11]。然而长期使用顺铂会产生不良反应和药物耐受，因此寻找一种既可以保证化疗疗效又可以减少化疗不良反应的药物或药物组合是抗肿瘤治疗的研究方向之一[12]。MCF-7细胞是广泛应用于乳腺癌发生、发展机制及治疗实验室研究的乳腺癌细胞系，本研究以MCF-7细胞为细胞模型，旨在探讨维生素C与顺铂联合用药对人乳腺癌细胞MCF-7的杀伤作用及机制。

1 材料与方法

1.1细胞与试剂 人乳腺癌细胞MCF-7购自美国模式培养物集存库。顺铂购自美国Sigma公司(批号：20170919)，维生素C注射液购自上海现代哈森药业有限公司(批号:17051516)。四氮唑盐比色法试剂盒由美国Thermo Fisher Scientific公司生产，FACSCalibur流式细胞仪由美国Becton,Dickinson and Company公司生产，胎牛血清购自杭州四季青公司。

1.2细胞培养及检测 将人乳腺癌细胞MCF-7置于含有10%胎牛血清的1640培养液37 ℃、5% CO2常规培养，培养条件为细胞铺满培养瓶80%时进行传代。

1.2.1四氮唑盐比色法检测不同浓度的维生素C和(或)顺铂对MCF-7细胞增殖的抑制作用 将对数生长期的MCF-7细胞用胰蛋白酶溶液消化后吹打均匀并调整细胞浓度为1×105/mL，用微量加液器移取至96孔板，每孔加100 μL，37 ℃、5% CO2培养24 h。镜下观察细胞生长情况、形态学变化，若发现96孔培养板中细胞已经贴壁生长，且形态正常，分别加入维生素C和顺铂，使维生素C终浓度为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 mmol/L，顺铂的终浓度为0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL；根据单独用药对细胞生长抑制率检测结果确定维生素C和顺铂联合用药剂量，联合用药时维生素C的终浓度为1 mmol/L，顺铂的终浓度分别为 0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL，组成8种组合。所有药物抑制作用检测实验均以不加药同期培养的细胞作为对照组，37 ℃、5% CO2培养48 h,同一药物、同一浓度均重复3孔。镜下观察细胞生长情况、形态学变化，四氮唑盐比色法检测不同浓度的维生素C和(或)顺铂对细胞生长的抑制率，细胞生长抑制率=(1-实验组OD均值/对照组OD均值)×100%，将MCF-7细胞抑制率为50%时维生素C和(或)顺铂的药物浓度记为半数细胞抑制浓度(inhibitory concentration 50，IC50)。

1.2.2流式细胞仪检测不同浓度维生素C和(或)顺铂对MCF-7细胞凋亡的影响 将对数生长期的MCF-7细胞浓度调整为1×105/mL，接种于6孔板中，常规培养24 h后，根据药物对MCF-7细胞的抑制作用结果，维生素C浓度分别选择0、0.5、1、2 mmol/L，顺铂浓度分别为0、2.5、5 μg/mL，组成12种联合用药组合，同一药物、同一浓度均重复3孔。37 ℃、5% CO2培养48 h后用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化，离心半径8 cm、800 r/min、4 ℃离心10 min后收集细胞，按照细胞凋亡试剂盒说明书进行操作，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.3蛋白质印迹法检测细胞凋亡相关蛋白表达 分别选择浓度为0、0.5、1、2 mmol/L的维生素C与5 μg/mL顺铂进行组合用药确定顺铂单独用药或与维生素C联合加入对数生长期的MCF-7细胞凋亡相关蛋白表达，以不加药同期培养的细胞作为对照组，37 ℃、5% CO2培养48 h，同一药物、同一浓度均重复3孔。收集细胞用磷酸盐缓冲液洗涤2遍收集到1.5 mL的EP管中，4 ℃、离心半径8 cm、150 00 r/min离心5 min，取上清液加入裂解液置于冰上反应5 min，4 ℃、离心半径8 cm、120 00 r/min离心10 min收集上清液即为蛋白，用蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白[胱天蛋白酶3(caspase-3)和B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)]的表达，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceral-dehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参。制备10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶，每孔加入各组收集蛋白10 μg，各组收集蛋白并进行电泳，半干法转膜，5%脱脂奶粉液封闭1 h，分别加入相应一抗 (1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜，TBST(Tris-HCl缓冲盐+吐温)洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000 稀释)，室温孵育2 h，应用增强型化学发光显色。美国伯乐凝胶图像处理系统对结果进行扫描并分析。

2 结 果

2.1维生素C和(或)顺铂对MCF-7细胞增殖的抑制作用 维生素C、顺铂单独用药和1 mmol/L 维生素C和顺铂联合用药的MCF-7细胞增殖抑制率比较差异均有统计学意义(P<0.05)。低浓度维生素C(≤1 mmol/L)对乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用小，浓度升高>1 mmol/L时，其对乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制率明显提高，且随着维生素C浓度升高抑制率增加，维生素C对MCF-7细胞的IC50为2.84 mmol/L。顺铂单独用药对乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用随药物浓度升高而增加，IC50为4.89 μg/mL。1 mmol/L的维生素C和不同浓度顺铂联合用药对乳腺癌细胞增殖的抑制作用随顺铂浓度升高而增加，IC50为2.14 μg/mL。维生素C和顺铂联合用药对MCF-7细胞增殖的抑制率明显高于维生素C或顺铂单独用药(P<0.05)。浓度≥1.25 μg/mL的顺铂和 1 mmol/L的维生素C联合用药对MCF-7细胞增殖的抑制率均明显高于顺铂单独用药(P<0.05)。按金氏公式计算q值均>1.15，提示1 mmol/L的维生素C与1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL 和10 μg/mL的顺铂有协同效应，增加了顺铂的敏感性。见表1。

2.2维生素C和(或)顺铂对MCF-7细胞凋亡的影响 维生素C与顺铂联合用药的MCF-7细胞凋亡率明显高于维生素C或顺铂单独用药(P<0.05)。对于维生素C用药组，0.5 mmol/L的维生素C与对照组的MCF-7细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)；1 mmol/L和2 mmol/L的维生素C对MCF-7细胞的凋亡率明显高于对照组(均P<0.05)。对于顺铂用药组，2.5 μg/mL和5.0 μg/mL顺铂对MCF-7细胞的凋亡率明显高于对照组(均P<0.05)。所有单独用药高剂量组的MCF-7细胞凋亡率均明显高于对应低剂量组(P<0.05)；所有联合用药组的MCF-7细胞凋亡率均明显高于单独用药(P<0.05)；所有联合用药高剂量组的MCF-7细胞凋亡率均明显高于对应低剂量组(P<0.05)。维生素C和顺铂单独用药或联合用药的MCF-7细胞凋亡率比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

维生素C抑制率顺铂抑制率维生素C+顺铂抑制率0.125 mmol/L1.87±0.430.312 5 μg/mL7.76±3.571 mmol/L+0.312 5 μg/mL11.89±3.860.25 mmol/L2.21±0.510.625 μg/mL14.76±4.801 mmol/L+0.625 μg/mL21.46±6.390.5 mmol/L2.87±0.471.25 μg/mL29.24±5.831 mmol/L+1.25 μg/mL46.17±5.781 mmol/L4.06±0.612.5 μg/mL39.82±4.471 mmol/L+2.5 μg/mL58.11±5.092 mmol/L42.51±2.415 μg/mL51.28±5.741 mmol/L+5 μg/mL70.88±6.314 mmol/L59.72±3.3010 μg/mL63.86±6.021 mmol/L+10 μg/mL84.10±6.378 mmol/L66.44±2.8720 μg/mL70.97±5.361 mmol/L+20 μg/mL90.12±4.5016 mmol/L74.93±2.4540 μg/mL78.56±5.091 mmol/L+40 μg/mL90.25±5.02F值17.837F值23.514F值42.906P值0.003P值0.003P值0.001

维生素C顺铂0 μg/mL2.5 μg/mL5.0 μg/mL0 mmol/L7.21±2.9015.47±3.40a29.68±3.08ab0.5 mmol/L10.45±3.2727.09±3.67ac41.55±4.07acd1 mmol/L 31.30±4.98ab40.66±4.02acd68.21±4.63acd2 mmol/L53.98±4.99ab68.40±4.51acd85.83±5.77acdF值16.94518.78733.200P值0.0030.0030.001

a与对照组比较，P<0.05；b与单独用药对应低剂量组比较，P<0.05；c与单独用药组比较，P<0.05；d与联合用药对应低剂量组比较，P<0.05

2.3蛋白质印迹法检测结果 与5 μg/mL顺铂单独用药相比，顺铂与维生素C联合用药的caspase-3表达量升高和Bcl-2表达下降(均P<0.05)。与对照组相比，5 μg/mL顺铂单独用药或与0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L 维生素C联合用药后MCF-7细胞促凋亡蛋白caspase-3的表达增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达减少；且1 mmol/L和2 mmol/L 维生素C与5 μg/mL顺铂联合用药的caspase-3表达明显高于顺铂单独用药(均P<0.05)，而Bcl-2的表达明显低于5 μg/mL顺铂单独用药(均P<0.05)。以GAPDH为内参，利用美国伯乐凝胶图像处理系统对结果进行扫描并分析，caspase-3和Bcl-2的表达与内参比值(Bcl-2/GAPDH)，见图1和表3。

3 讨 论

维生素C在肿瘤治疗中的作用广泛。研究认为，维生素C对肿瘤具有治疗作用[5-8]，但有研究认为维生素C不能抑制恶性肿瘤进展，延长患者生存时间[13]。近年有学者发现，维生素C对肿瘤的治疗作用与血药浓度相关，高剂量维生素C对癌细胞具有杀伤作用[7,14]。另外，有学者在研究维生素C的抗肿瘤机制时发现维生素C可通过协同效应增敏其他抗肿瘤药物[15-16]。本研究分析0.125～16 mmol/L倍比递增维生素C浓度对乳腺癌细胞MCF-7的杀伤作用，发现低浓度维生素C(≤1 mmol/L)对MCF-7细胞的抑制率(≤2.23%)低，而维生素C浓度>1 mmol/L时，其对MCF-7细胞的抑制率显著上升且呈浓度依赖性，提示维生素C对癌细胞的杀伤作用与浓度相关，只有达到一定的细胞浓度才能有效抑制细胞增殖，表明在维生素C治疗肿瘤时应考虑维生素C在消化道的吸收率，以保证细胞药物浓度，故建议注射用药，这与刘珊和韩艳秋[17]对维生素C对顺铂治疗大鼠卵巢癌疗效的影响研究结果一致。然而在肿瘤治疗中，无论是维生素C还是本研究用的肿瘤治疗经典药物顺铂均有不良反应，特别是高剂量时不良反应尤为明显[18]。本研究结果显示，1 mmol/L 维生素C与不同浓度顺铂联合用药对MCF-7的抑制率均高于同浓度顺铂单独用药，其中顺铂单独用药对乳腺癌细胞MCF-7增殖的IC50为4.89 μg/mL，当顺铂与1 mmol/L的维生素C联合用药后IC50为2.14 μg/mL，而1 mmol/L 维生素C对MCF-7细胞增殖的抑制率仅为2.23%，1 mmol/L 维生素C与较低浓度的顺铂联合能起到很好的肿瘤杀伤作用，且不良反应较少,提示1 mmol/L的维生素C对较低浓度的顺铂有协同增敏效应。

VitC：维生素C；Bcl-2：B细胞淋巴瘤/白血病-2；caspase-3：胱天蛋白酶3；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

图1顺铂单独用药或联用不同浓度维生素C后MCF-7细胞caspase-3和Bcl-2的表达

组别caspase-3/GAPDHBcl-2/GAPDH对照组10.52±1.01230.29±14.205 μg/mL顺铂80.78±5.67a157.34±10.49a5 μg/mL顺铂+0.5 mmol/L 维生素C111.58±8.51a124.89±8.94a5 μg/mL顺铂+1 mmol/L 维生素C176.04±10.61ab74.71±5.62ab5 μg/mL顺铂+2 mmol/L 维生素C240.12±12.07ab20.80±4.10abF值87.96793.221P值<0.001<0.001

caspase-3：胱天蛋白酶3；Bcl-2：B细胞淋巴瘤/白血病-2；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；a与对照组比较，P<0.05；b与5 μg/mL顺铂单独用药比较，P<0.05

细胞增殖和凋亡均是复杂的多基因调控过程，它们同时受到各种原癌基因及抑癌基因的双向调控[19]。其中，Bcl-2是常见的抑制凋亡基因，有延长细胞生存周期的作用，还可作用于线粒体通过抑制促凋亡蛋白发挥作用；caspase-3是细胞凋亡最关键的酶，可促进凋亡[20-21]。本研究结果显示，5 μg/mL顺铂或5 μg/mL 顺铂与不同浓度维生素C联合作用对MCF-7细胞的凋亡率明显高于对照组；维生素C的浓度为1 mmol/L时，其与5 μg/mL顺铂联合用药对MCF-7细胞的凋亡率明显高于5 μg/mL顺铂单独用药。提示，Bcl-2和caspase-3与5 μg/mL顺铂单独用药或与维生素C联合用药促进MCF-7细胞的凋亡作用，其机制可能是通过抑制Bcl-2的表达和促进caspase-3的表达发挥促MCF-7细胞凋亡作用。

综上所述，维生素C和(或)顺铂可抑制MCF-7细胞增殖并促进其凋亡，且联合用药效果优于单独用药。1 mmol/L的维生素C对顺铂抑制MCF-7细胞增殖有增敏作用，顺铂诱导细胞凋亡的机制可能是通过促进caspase-3和抑制Bcl-2的表达实现。