虫草益肾方对单侧输尿管梗阻大鼠Wnt/β联蛋白信号通路影响的实验研究

马晓鹏，宋立群，杨红利，周琪，李佳琦，范桢亮，贠捷，宋业旭

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院肾病科，哈尔滨150040； 2.黑龙江中医药大学，哈尔滨150040)

慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)是由多种原发性或继发性肾脏疾病导致的慢性肾脏疾病。自2002年美国肾脏病及透析临床实践指南提出CKD的理念及定义后，十余年内CKD发病率不断增加，已成为一种严重威胁人类健康的慢性疾病。肾间质纤维化是CKD进展至终末期肾脏病的病理表现和途径。既往研究证明，肾间质纤维化是一个涉及氧化应激、炎症反应以及与转化生长因子-β/Smad和Wnt/β联蛋白(β-catenin)等多条细胞信号通路密切相关的病理变化[1]。其中Wnt/β-catenin信号通路是近年来研究较为广泛的一个细胞信号通路，研究发现其在糖尿病肾病、梗阻性肾病和多囊肾中均有明显活化[2]。进一步研究发现Wnt/β-catenin信号通路在急性和慢性肾损伤中发挥截然不同的作用，表明可能成为干预肾间质纤维化的新的重要靶点[3]。

虫草益肾方是宋立群教授根据多年临床及科研工作拟定的经验方，前期已有大量临床和动物研究证明虫草益肾方在防治肾间质纤维化中具有多靶点、多环节、多角度的优势。虫草益肾方可以通过调节核因子κB及相关细胞因子的表达延缓CKD进展，抑制肾间质纤维化[4]。本课题旨在分析虫草益肾方对Wnt/β-catenin信号通路的干预作用及与福辛普利作用靶点的差异，探究其与药效的关系，从而阐明虫草益肾方多途径、多靶点防治肾间质纤维化的优势。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 清洁级雄性Wistar大鼠50只，体重180～200 g，平均(200±20) g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心[许可证号：SYXK(黑)2013-012]，饲养于临床分子生物学实验室(中医管理局Ⅲ级重点实验室)，饲养环境保持湿度40%～70%，温度恒定在(22±2) ℃，给予实验大鼠12/12 h昼夜循环。

1.1.2药品与试剂 中药饮片(黄芪、大黄、水蛭、草豆蔻、猫须草)购自黑龙江中医药大学附属第一医院。冬虫夏草菌丝粉由江西济民可信集团提供(批号：180521)。福辛普利(商品名：蒙诺)购自中美上海施贵宝制药有限公司(批号：P2018627151130753)。

肌酐(SBJ-R0120)、尿素氮(SBJ-R0119)、尿蛋白(SBJ-R1384)检测试剂盒购自德国罗氏诊断有限公司；苏木精购自上海标本模型厂(329D0312)；兔Wnt4(K005478P)、Wnt5a(BA23921)、基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7,MMP-7)(K001731P)多克隆抗体购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.3仪器设备 PL602-S精密电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；日立-7170A型自动生化分析仪(日本日立公司)；HZS-HA水浴振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；电泳仪、电泳槽及凝胶成像分析系统[伯乐生命医学产品(上海)有限公司]。

1.2方法

1.2.1动物分组 将50只Wistar大鼠根据随机数字法分为空白组10只，假手术组10只，以及造模组30只。造模组在建立单侧输尿管梗阻模型后再随机分为模型组、虫草益肾方组、福辛普利组，每组10只。

1.2.2单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)模型建立 大鼠适应性喂养1周后进行手术造模，于造模前24 h禁食不禁水。采用10%水合氯醛以0.3 mL/100 g的剂量腹腔注射麻醉。常规固定麻醉后的大鼠，备皮、消毒、铺巾，于大鼠左侧腹肾区切口，钝性分离左侧输尿管，用4-0手术线，在肾盏处和肾下极处分别结扎并离断输尿管。手术后将肾脏置于原位，局部给予适量的注射用青霉素，逐层缝合肌肉与皮肤，手术切口处。空白组不做任何处理，假手术组仅游离左肾输尿管，但不结扎离断。

1.2.3药物制备 将黄芪、大黄、水蛭、草豆蔻、猫须草混合后用冷水浸泡2 h，每次煎煮40 min，煎煮2次后将得到水煎液混合，使用旋转蒸发仪将水煎液浓缩成含生药0.657 g/mL的浓缩液，密闭避光保存于4 ℃冰箱中，保质期3 d。福辛普利用无菌注射用水配置成0.09 mg/mL的水溶液，密闭避光保存于4 ℃冰箱中，给药当日现配现用。

1.2.4给药方法 造模组术后第1天开始给予灌胃治疗，其中虫草益肾方组大鼠给予10 mL/kg虫草益肾方水煎液灌胃，福辛普利组给予10 mL/kg福辛普利水溶液灌胃，空白组、假手术组和模型组给予同体积的0.9%氯化钠注射液灌胃，连续给药28 d。

1.2.5样本采集 于给药后的第27天灌胃后将各组大鼠置于代谢笼中收集24 h尿液，记录尿量，用于24 h尿蛋白定量测定。第28天给药后2 h，用10%水合氯醛以0.3 mL/100 g的剂量腹腔注射麻醉大鼠。常规固定麻醉后的大鼠，备皮、消毒、铺巾，腹部正中线行纵向切口，暴露大鼠下腔静脉。采集下腔静脉血5 mL，相对离心力29 200×g,离心10 min分离血清，用于肌酐、尿素氮检测。随后游离大鼠双侧肾脏，称取肾脏重量后将梗阻侧肾组织沿肾门部切成两部分，上部肾组织用于肾间质纤维化的病理学检测(苏木精-伊红染色与Masson染色)，中部及下部肾组织采用Western blot检测相关分子生物学指标(Wnt4、Wnt5a以及MMP-7)。

1.2.6肾组织形态学观察 肾组织采用10%甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成3 μm 厚切片，中性树胶封片，并行苏木精-伊红染色与Masson染色。Masson染色在200倍光镜下观察肾间质胶原纤维染色，每组选取10张切片，每张切片选取不重复的10个视野。借助HMIAS-2000系统计算纤维化面积占整个视野肾间质面积的百分比(排除肾血管、肾小球、肾小管所占面积)。

1.2.724 h尿蛋白定量与肾功能检测 采用日立-7170A型自动生化分析仪进行24 h尿蛋白定量、血肌酐和尿素氮的检测。

1.2.8Western blot检测蛋白表达 细胞裂解液(磷酸盐缓冲溶液∶乙二胺四乙酸∶蛋白酶抑制剂=100∶1∶1)提取肾组织总蛋白，将混合液置于冰上，匀浆。匀浆后在冰上静置30 min，相对离心力29 200×g，离心15 min后取上清液。二喹啉加酸法测定蛋白浓度，根据蛋白marker位置切下目的蛋白所在的聚丙烯酰胺凝胶电泳；将蛋白转至聚偏氟乙烯膜后，Tris-HCl-Tween缓冲盐溶液洗膜3次，每次5 min。室温下二抗孵育1 h，化学发光成像仪中显影。目的蛋白与内参照β-actin吸光度值之比为该蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1肾组织外观 造模时肉眼观察各个大鼠双侧肾脏，空白组、假手术组、模型组、虫草益肾方组以及福辛普利组并未发现肉眼可见的差异。第28天取材时发现模型组结扎侧肾脏均较对侧肾脏明显肿大，颜色呈暗红色或紫红色，肾盂、肾盏扩张。切开肾脏后发现肾盂积水，肾盂内可见大量淡黄色或暗紫色胶冻样血块，肾皮质变薄。虫草益肾方组与福辛普利组大鼠也均可见上述典型表现，但较模型组轻，空白组与假手术组均未见上述表现。说明造模时已顺利结扎了左输尿管，所有大鼠均成功建立UUO大鼠模型，见图1。

2.2肾组织形态学观察 显微镜下观察空白组和假手术组大鼠肾组织，未见明显的病理改变，肾间质无炎症细胞浸润及纤维组织形成。模型组造模后28 d发现大部分肾小球硬化坏死，肾小管重度扩张或萎缩，间质大面积炎症细胞浸润。可见间质局灶性出血，局灶肾小管上皮细胞脱落，部分小管腔内可见红细胞管型和透明管型，肾间质纤维化，几乎观察不到正常肾组织。虫草益肾组和福辛普利组大鼠的肾组织也可见明显的肾小管扩张，间质炎症细胞浸润，红细胞管型和透明管型，肾间质纤维化与肾小球硬化，但程度明显较模型组轻微，见图2。

1a：正常大鼠双肾； 1b：UUO大鼠双肾； 1c：UUO大鼠双肾剖面; UUO：单侧输尿管梗阻

HE：苏木精-伊红

2.3各组大鼠肾组织纤维化水平比较 各组大鼠纤维化面积比较差异有统计学意义(P<0.01)，模型组、虫草益肾方组、福辛普利组肾间质纤维化面积大于空白组和假手术组(P<0.05)，虫草益肾方组、福辛普利组小于模型组(P<0.05)，假手术组与空白组肾间质纤维化面积比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

组别只数肾纤维化面积空白组102.19±0.21假手术组102.20±0.26模型组1050.31±3.54ab虫草益肾方组1043.57±2.11abc福辛普利组1046.76±4.10abcF值891.684P值<0.001

a与空白组比较，P<0.05；b与假手术组比较，P<0.05；c与模型组比较，P<0.05

2.4理化指标

2.4.1各组大鼠24 h尿量和24 h尿蛋白定量比较 第28天时，各组大鼠24 h尿量与24 h尿蛋白定量比较差异有统计学意义(P<0.01)。模型组、虫草益肾方组、福辛普利组24 h尿量低于空白组、假手术组(P<0.05)，虫草益肾方组、福辛普利组高于模型组(P<0.05)，福辛普利组高于虫草益肾方组(P<0.05)，空白组与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)；模型组、虫草益肾方组、福辛普利组24 h尿蛋白定量高于空白组、假手术组(P<0.05)，虫草益肾方组、福辛普利组低于模型组(P<0.05)，福辛普利组高于虫草益肾方组(P<0.05)，空白组与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4.2各组大鼠血尿素氮与血肌酐比较 第28天时，各组大鼠血尿素氮与血肌酐比较差异有统计学意义(P<0.01)。模型组、虫草益肾方组以及福辛普利组血尿素氮、血肌酐水平均高于空白组和假手术组(P<0.05)，虫草益肾方组血尿素氮低于模型组(P<0.05)，虫草益肾方组和福辛普利组血肌酐低于模型组(P<0.05)，空白组与假手术组血尿素氮与血肌酐水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

组别只数24 h尿量(mL)24 h尿蛋白定量(g)空白组1018.18±2.702.04±0.20假手术组1018.91±1.711.98±0.24模型组108.15±1.39ab10.24±1.34ab虫草益肾方组1013.16±3.59abc4.49±1.34abc福辛普利组1014.82±2.74abc5.87±0.54abcdF值28.815234.875P值<0.001<0.001

a与空白组比较，P<0.05；b与假手术组比较，P<0.05；c与模型组比较，P<0.05；d与虫草益肾方组比较，P<0.05

组别只数血尿素氮(mmol/L)血肌酐(μmol/L)空白组105.45±0.5530.09±4.67假手术组105.96±2.8427.44±5.05模型组1013.26±1.91ab72.94±5.48ab虫草益肾方组109.50±2.78abc49.93±6.85abc福辛普利组1011.31±1.91ab62.97±3.01abcdF值24.312149.098P值<0.001<0.001

a与空白组比较，P<0.05；b与假手术组比较，P<0.05；c与模型组比较，P<0.05；d与虫草益肾方组比较，P<0.05

2.4.3各组大鼠肾组织Wnt4、Wnt5a和MMP-7水平比较 第28天时各组大鼠肾组织Wnt4、Wnt5a和MMP-7表达水平比较差异有统计学意义(P<0.01)。模型组Wnt4表达水平高于空白组和假手术组(P<0.05)，福辛普利组高于假手术组(P<0.05)，虫草益肾方与福辛普利组均低于模型组(P<0.05)，空白组和假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)；模型组、虫草益肾方组以及福辛普利组Wnt5a、MMP-7高于空白组和假手术组，虫草益肾方组和福辛普利组低于模型组(P<0.05)，空白组和假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4、图3。

组别只数Wnt4Wnt5aMMP-7空白组100.229±0.0280.496±0.0490.016±0.002假手术组100.158±0.0150.307±0.0730.016±0.006模型组101.738±0.793ab6.660±0.363ab4.445±0.310ab虫草益肾方组100.419±0.041c1.418±0.029abc1.068±0.088abc福辛普利组100.614±0.072bc1.277±0.063abc0.722±0.051abcF值32.5212 393.3591 590.451P值<0.001<0.001<0.001

MMP-7:基质金属蛋白酶7；a与空白组比较，P<0.05；b与假手术组比较，P<0.05；c与模型组比较，P<0.05

MMP：基质金属蛋白酶

3 讨 论

肾间质纤维化是多种CKD最终都要经历的病理改变，肾间质纤维化时肾脏的固有结构被增生的纤维组织替代，肾功能逐渐丧失。近年来，肾间质纤维化在CKD进展中的重要性逐渐被认识，延缓肾间质纤维化进展逐渐成为临床治疗CKD的重要举措[5-7]。大量研究表明中医药防治CKD具有多靶点、不易产生耐药性、长期使用不良反应少、临床疗效肯定等优点，逐渐得到临床肾脏病医师的认可[8-13]。中医学认为CKD病机是以“正虚邪实”为关键，正虚是以肺、脾、肾三脏不足为主，邪实是以体内“浊、痰、瘀、毒”壅盛为标。“虚”“浊”“痰”“瘀”“毒”五大环节，贯穿于CKD发生、发展的全过程。因此，治疗CKD应标本兼顾，扶正祛邪。

宋立群教授基于中医“气化”学说，提出了“补肺健脾益肾，泄浊祛瘀解毒”的治疗原则，并总结出经验方虫草益肾方，得到了较好的临床效果[9-10,14-15]。虫草益肾方由冬虫夏草菌丝粉、黄芪、大黄、水蛭、草豆蔻、猫须草6味药物组成。其中虫草甘温，重在补肺益肾。大黄泄浊祛瘀解毒，黄芪重在健脾化痰，猫须草利水解毒，水蛭破血逐瘀，草豆蔻长于燥湿健脾，芳化疏利，旨在恢复三焦气化。方中虫草、黄芪为主药，意在补肺健脾益肾，大黄、水蛭、草豆蔻、猫须草为辅药，意在泄浊祛瘀解毒。药虽六味，性味归经，虫草主入，黄芪主升，大黄主降，猫须草、水蛭、草豆蔻主出，充分体现了“气化”学说的升降出入原则[8,16-18]。

Wnt/β-catenin信号通路是近年来在CKD领域研究较为广泛的一个细胞信号通路。体内外研究均表明，Wnt/β-catenin信号通路下游调控着数个与肾间质纤维化密切相关的靶基因，如Snail1、纤溶酶原激活物抑制剂-1、MMP-7等[19]。Wnt/β-catenin信号通路的活化与肾间质纤维化的进展密切相关，靶向抑制Wnt/β-catenin信号通路可以有效抑制成纤维细胞的增殖与活化[20]，上皮细胞的表型转换[21]，抑制UUO大鼠肾间质纤维化的进展[22]。近年来实验研究发现，经典途径的Wnt/β-catenin信号通路较非经典途径的Wnt/β-catenin信号通路在UUO导致的肾间质纤维化发病中发挥更重要的作用[23]。部分中药单体抗纤维化的研究证明，某些中药单体成分可以通过干预Wnt/β-catenin信号通路发挥抗纤维化的作用机制，表明Wnt/β-catenin信号通路同样可能是中药抗肾间质纤维化的重要治疗靶点[5-7]。

本研究结果显示，单侧输尿管梗阻后第28天，UUO大鼠24 h尿蛋白定量明显升高，血肌酐、尿素氮水平显著升高，高于正常大鼠与假手术组大鼠(P<0.05)。在给予大鼠虫草益肾方或福辛普利干预后，大鼠24 h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮水平较模型组明显降低(P<0.05)，有效保护了大鼠肾功能。此外，UUO大鼠肾组织中Wnt4、Wnt5a以及MMP-7水平均较正常大鼠显著升高，而运用虫草益肾方或福辛普利干预后，大鼠肾组织中Wnt4、Wnt5a以及MMP-7水平均较模型组有所降低(P<0.05)。说明Wnt/β-catenin信号通路与UUO大鼠梗阻肾组织纤维化进展密切相关，UUO大鼠梗阻肾组织中Wnt4/Wnt5a以及MMP-7水平均明显升高，且与大鼠梗阻肾组织正常结构被破坏，炎症细胞浸润，肾间质纤维化以及肾小球硬化的程度保持一致。各组间Wnt/β-catenin信号通路相关分子的表达水平与其肾间质纤维化程度保持一致，说明Wnt/β-catenin信号通路的活化与UUO大鼠肾间质纤维化密切相关，Wnt/β-catenin信号通路会进一步加重UUO大鼠肾间质纤维化的进展。

本研究进一步研究发现，给予大鼠虫草益肾方或福辛普利干预均可有效抑制UUO大鼠梗阻肾组织中Wnt/β-catenin信号通路活化以及相关信号分子的表达。同时虫草益肾方与福辛普利均可有效抑制UUO大鼠梗阻肾组织的结构损伤与破坏，减轻肾组织中炎症细胞的浸润，延缓肾间质纤维化以及肾小球硬化的进展。虫草益肾方对UUO大鼠梗阻肾组织中Wnt/β-catenin信号通路以及肾间质纤维化的抑制作用明显大于福辛普利，说明Wnt/β-catenin信号通路的活化可能是UUO大鼠肾间质纤维化发生发展的重要信号通路，且其可能是虫草益肾方与福辛普利治疗肾间质纤维化的重要机制之一，值得深入研究。

总之，肾间质纤维化是多种慢性肾脏损伤的共同病理改变，各种原因引起的肾损伤均可能通过多种机制导致肾间质纤维化。中药复方具有多种有效成分，通过同时干预多个靶点而发挥疗效的特殊作用机制已得到广大学者的认可。虫草益肾方作为典型的中药复方，同样具有这一特点。虽然虫草益肾方在延缓肾间质纤维化的疗效上已得到大量临床研究和实验研究的证实，但具体作用机制的研究尚属于初始阶段，仍需要进一步的研究与探讨。