YAP介导的力学信号转导在血管生成中的研究进展

鲍远，聂铭博，施佳，李孟伟，康皓

(华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科,武汉 430030)

随着组织工程技术的兴起，利用人工支架修复皮肤软组织缺损的研究越来越广泛，并且部分支架已经应用于临床。然而单纯的支架移植并不能取得良好的临床效果，其中一个重要原因是植入体内的支架中难以形成血管。因此，如何将正常结构的血管网络整合到人工支架中是组织工程领域的一个重要挑战。为了解决这一问题，在支架中接种血管生成细胞(干细胞或祖细胞)成为一种较常见的预处理方式[1]。除了过去研究最广泛的生物化学因素，近年来发现机械力在血管生成中也起重要作用[2]。力学因素能够影响内皮细胞的增殖分化、功能行为以及形成血管网络结构的能力，因此人工支架的微结构和机械力学性能对其中的内皮细胞形成血管具有重要影响[3]。

细胞从感知外环境中的力学刺激到发生基因转录水平的变化称为力学信号转导。力学信号转导能使细胞感知外界力学刺激信号并对其做出应答，该过程涉及肌动蛋白细胞骨架的快速重构并激活特定基因，从而调控细胞的增殖、分化、迁移等生物学行为[4]。近年来研究发现，Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)受多种机械力学的调控，同时也是力学信号转导过程中的关键环节[5-6]。现对YAP介导的力学信号转导在调控血管再生中的作用和机制进行归纳和总结。

1 Hippo信号通路及其效应因子YAP

YAP与c-Yes酪氨酸激酶作用相关，因而被命名为Yes相关蛋白[7]。YAP作为一种协同转录因子，必须与转录因子结合才能促进相关基因的转录。其结构中含有WW结构域和TEAD结合区域，能识别并结合多种转录因子。其中，有关转录因子复合体YAP-TEAD所介导的生物学功能研究报道较多，研究认为TEAD是介导YAP功能的关键转录因子[8]。如果YAP或TEAD基因发生突变导致两者无法结合，则会显著抑制细胞增殖和组织生长[8]。YAP是位于人类染色体11q22上的扩增子，在人体很多癌症中可以发现YAP的表达异常增多，尤其在肝癌中[9]。在小鼠肝细胞内过表达YAP会导致肝脏体积增大以及肿瘤的发生，提示YAP在器官发育调控和肿瘤发生方面起重要作用[10]。

YAP是Hippo通路的直接效应因子。YAP活化后能够促进细胞增殖、组织器官生长以及细胞癌变，而Hippo通路通过抑制YAP活性调控组织细胞增殖和器官体积[11]。如小鼠的肝脏被切除2/3后，剩余肝脏再生到正常体积时就会停止生长；此外，在体外培养时，细胞与邻近其他细胞的接触会导致其增殖受到抑制[12]。在哺乳动物中Hippo通路的核心成员包括哺乳动物STE20相关蛋白激酶(mammalian STE20-like protein kinase，MST)1/2、Salvador同源物1(Salvador homolog 1，SAV1)、大肿瘤抑制因子同源物(large tumor suppressor homologue，LATS)1/2和MOB激酶激活因子1(MOB kinase activator 1，MOB1)。MST1/2和LATS1/2属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它们相继发生磷酸化后形成激酶级联反应，从而激活Hippo通路。SAV1和MOB1是支架蛋白，前者为MST1/2和LATS1/2的作用提供结构支持；后者能被MST1/2磷酸化，磷酸化后的MOB1结合LATS1/2的能力增强，从而增加LAT1/2激酶的活性。沉默SAV1或降低MOB1的磷酸化水平均能抑制Hippo通路的活性，因此SAV1-MST1/2或MOB1-LATS1/2复合体的完整性是Hippo信号通路发挥功能的结构基础。Hippo通路激活后，活化的LATS1/2将YAP磷酸化。磷酸化的YAP在胞质中与14-3-3蛋白结合，其活性因此被抑制。相反，当Hippo通路被抑制，YAP去磷酸化并进入细胞核，与转录因子TEAD1-4结合从而启动目的基因的转录[11]。组织再生过程涉及组织来源干细胞的增殖、迁移、分化等过程，组织损伤后Hippo-YAP信号通路动员干细胞，并调控其增殖、迁移、分化等生物学行为，在组织损伤修复过程中具有重要作用[13]。

2 力学信号转导

2.1肌动蛋白细胞骨架在力学信号转导中的作用 在细胞增殖、分化、迁移以及干细胞特性维持的过程中，细胞间接触、细胞外基质硬度、流体剪切力等力学信号无处不在，并发挥重要调控作用[14-16]。细胞表面整合素受体形成的黏附斑是细胞感知力学信号的重要结构。通过该结构细胞能够感知来自相邻细胞、细胞外基质和黏附位点的机械应力，并通过调节细胞骨架的结构和张力来适应细胞外的力学环境，从而维持细胞的形态并调控增殖、分化、凋亡、迁移等生物学行为[17]。丝状肌动蛋白(fibrous actin,F-actin)是构成细胞骨架的重要成分，它是由单体的球形肌动蛋白(globular actin,G-actin)聚合而成。肌动蛋白细胞骨架形成后处于解聚与合成的动态平衡中，并受多种因素的调节，从而能够对力学刺激作出迅速的应答[18]。细胞处于硬度较大的细胞外基质中，F-actin合成增多并形成应力纤维，且细胞伸展出细长的丝状伪足；相反，细胞在硬度较小的细胞外基质中，F-actin发生解聚形成单体的G-actin，且细胞缩小呈圆形[19]。肌动蛋白细胞骨架处于解聚与合成的动态平衡中并受到Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil forming kinase,ROCK)信号通路的调控。ROCK被GTP-RhoA激活后，导致肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)磷酸化而被激活，活化的MLC促进肌动蛋白细胞骨架收缩，增加细胞张力，从而使细胞伸展。除直接磷酸化MLC，ROCK还可以通过磷酸化MLC磷酸酶的调节亚基肌球蛋白磷酸酶靶向亚单位1来抑制MLC磷酸酶活性,从而间接增加MLC的磷酸化水平。此外，ROCK能激活LIM激酶，后者使丝切蛋白磷酸化并抑制其对细胞骨架的解聚作用，从而促进肌动蛋白细胞骨架的形成[20]。用抑制剂Y-27632抑制ROCK或拉春库林B直接解聚F-actin会导致细胞处于低张力状态，此时细胞的增殖、迁移等生物学行为不再受到外界机械力刺激的影响[19]。上述实验证实肌动蛋白细胞骨架的结构和动力学改变在力学信号转导过程中发挥重要作用。

2.2YAP在力学信号转导中的作用 Hippo-YAP通路上游的调控因素非常广泛，除多种生物化学信号外，还包括细胞外基质硬度、细胞间或细胞与基质的黏附、细胞密度、细胞形态等机械力学信号。这些上游的机械刺激均会引起肌动蛋白细胞骨架结构和动力学的改变[21]。在肌动蛋白细胞骨架介导的力学信号转导过程中YAP发挥关键的作用[22]。机械力学信号能影响YAP的磷酸化水平，细胞在硬度较大的细胞外基质上生长时，YAP发生去磷酸化并进入细胞核，从而启动目的基因的转录；相反，细胞在硬度较小的细胞外基质上生长时，YAP发生磷酸化并滞留在胞质中，相关基因的表达被抑制[19]。为了进一步确定机械力调控YAP的机制，研究者将细胞接种至不同面积的纤连蛋白涂层上，涂层面积的大小决定细胞黏附后的伸展面积。研究发现，在面积较大的纤连蛋白涂层上，细胞充分伸展，YAP被激活；而在面积较小的纤连蛋白涂层上，YAP的活性被抑制。改变基质的硬度后再重复上述实验仍能得到相同的结果[19]。该研究认为细胞的形态和大小能调控YAP的活性，而其机制可能与细胞中F-actin的数量有关。体积较大的细胞内有更多的F-actin形成，从而导致YAP被激活。用拉春库林B解聚F-actin则会导致YAP的磷酸化水平升高而失活。因此，F-actin通过对YAP活性的调控将外部的机械力学刺激转化为生物化学信号，从而调控相关基因的转录活性[19]。在不同的发育阶段和组织类型中，F-actin通过调控YAP活性影响细胞的生物学行为。如在果蝇三龄幼虫的翅成虫盘中，加帽蛋白的功能缺陷或形成蛋白同源物Dia过表达会导致F-actin合成增多，从而促进细胞增殖和组织过度生长[21,23]。此外，基质硬度、细胞形态、张应力等机械力刺激通过肌动蛋白细胞骨架对YAP活性的调控能诱导间充质干细胞向特定细胞系的分化[19]。因此，YAP在力学信号转导过程中发挥关键的作用。

3 力学信号转导在血管生成中的作用

血管形成过程是一个复杂和多步骤的过程，伴随着血管内皮细胞的增殖、迁移和生存。该过程受多种生长因子的调控，其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是主要的驱动因素，其对血管功能的影响是目前研究的热点[24]。在血管内皮细胞中，VEGF受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)主要有VEGFR1和VEGFR2。VEGFR2与VEGF结合时发生自磷酸化并被激活，通过一系列下游信号的转导，最终促进内皮细胞增殖、迁移和血管生成[25]。VEGF与VEGFR2结合后引起的细胞内信号通路的变化已被广泛研究，但VEGF信号传递到细胞核内并启动相关基因转录程序的机制以及这些基因转录的具体作用仍不清楚[26]。

在皮肤组织工程的研究中，VEGF被加入人工支架中以促进血管的形成[3,26]。然而在部分支架中，加入VEGF的内皮细胞也无法形成正常而稳定的血管结构。研究发现，YAP是血管形成过程中必不可少的因子，并且在此过程中VEGF能激活YAP的协同转录功能[26]。敲除小鼠体内VEGF基因会使胚胎和卵黄囊的血管严重畸形，从而导致胚胎死亡[24]。此外，敲除YAP基因后，卵黄囊内也出现明显的血管缺陷，并导致胚胎发育停滞[27]。VEGF能够诱导内皮细胞中结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)和富半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich protein 61,CYR61)的表达，同时也是YAP的靶基因[28]。转录因子TEAD1-4能与协同转录因子YAP结合并启动相关基因的表达，有研究证实TEAD4是VEGF诱导内皮细胞成血管过程中所必需的转录因子[29]。研究显示，在新生血管前端的内皮细胞中，YAP表达量丰富且定位于细胞核，表明血管生成过程中伴随着YAP的大量激活。此外，在处于发育阶段的动物体内沉默YAP基因会导致视网膜血管发育障碍[28,30]。这些研究均提示YAP参与血管生成的过程，而且VEGF能调控YAP的活性。在体外实验中，用VEGF刺激内皮细胞可以发现YAP去磷酸化并进入细胞核，同时YAP的靶基因CTGF和CYR61的表达明显上调。沉默YAP基因后，通过划痕实验和成管实验证实内皮细胞的迁移能力和血管形成能力明显下降，而且VEGF不再增强内皮细胞的迁移能力和血管形成能力，同时VEGF也不再促进CTGF和CYR61的表达。此外，阻断VEGFR2能抑制VEGF诱导的YAP去磷酸化的作用[26]。上述研究证实了VEGF作用于VEGFR2后通过激活YAP来启动血管生成的过程。

在血管生成的过程中，内皮细胞从激活、增殖到新生血管形成，除多种化学信号参与外，还涉及力学信号的转导过程，力学信号是调控血管内皮细胞黏附、迁移、血管生成等生物学行为的重要因素[4]。研究已证实，VEGF能够调控肌动蛋白细胞骨架重构并促进内皮细胞迁移[31]。完整的细胞骨架对于VEGF诱导YAP活化是必需的。用拉春库林B解聚F-actin能够提高YAP的磷酸化水平并使其停留在细胞质内而失去转录活性[30]。VEGF能诱导YAP去磷酸化并进入细胞核启动靶基因的转录，而在拉春库林B存在的情况下VEGF则会失去这一作用[26]。因此，VEGF诱导YAP活化与肌动蛋白细胞骨架重构有关。Src家族激酶是已知的VEGF-VEGFR2下游的信号分子，能够调控VEGF介导的肌动蛋白细胞骨架重构，从而促进内皮细胞迁移和血管的侵袭[32]。用Src家族激酶的特异性抑制剂PP2抑制其活性，能阻断VEGF引起的YAP去磷酸化、核内定位以及其靶基因的表达。RhoA激活ROCK信号通路后能够促进肌动蛋白细胞骨架合成并形成应力纤维，从而降低YAP的磷酸化水平并促进其进入细胞核内启动相关基因转录[33]。然而，用RhoA的特异性抑制剂C3抑制其活性后ROCK激酶活性被抑制，此时VEGF不再对YAP的磷酸化和亚细胞定位产生影响。这些研究进一步证实了VEGF通过肌动蛋白细胞骨架的重构来调控YAP的活性。YAP是Hippo信号通路的直接效应因子，研究证实VEGF能降低LATS1的磷酸化水平，提示VEGF调控YAP的活性需要Hippo和肌动蛋白细胞骨架的参与[26]。综上所述，VEGF启动的血管生成过程与力学信号转导有关。

4 小 结

随着对生物力学研究的不断深入，力学信号转导在调控细胞增殖、分化、迁移等方面的重要作用逐渐被认识到，尤其在组织工程研究领域。在血管再生过程中，血管内皮细胞感知环境中的力学信号，并使肌动蛋白细胞骨架发生快速重构，从而激活YAP并启动相关基因的转录，最终促进内皮细胞的增殖、迁移以及形成血管。在细胞感知机械力刺激到发生基因转录水平的变化，YAP介导的力学信号转导是不可或缺的过程。将血管网络整合到人工支架中仍是各组织工程领域所面临的重大挑战，随着3D打印技术的发展，目前可以构建精确几何结构和层次结构的血管形态。在这种血管形态结构中施加外力或调节内皮细胞所受到的机械应力，则能够调控内皮细胞形成血管的能力，这可能成为未来组织工程支架研究的新思路。因此，理解机械应力调控内皮细胞形成血管的机制，有助于推动人工支架在皮肤软组织缺损治疗中的应用。