TRF及其在肿瘤中作用的研究进展

单世婷，朱春富

(1.南京医科大学研究生学院，南京 210029；2.南京医科大学附属常州第二人民医院肝胆外科，江苏 常州 213000)

转运RNA(transfer RNA,tRNA)衍生片段(tRNA-derived fragments,TRF)是指转运RNA(transfer RNA,tRNA)来源的小片段RNA，由特定核酸酶(如RNA内切酶和血管生成素)在特定细胞或组织中或某些条件下(如应激和缺氧)对tRNA的特异性切割产生的片段[1]。TRF属于非编码RNA家族成员。非编码RNA是一种不具有翻译成蛋白质能力的RNA,广泛存在于各种细胞中，在生物体中发挥广泛的作用。作为经典的非编码RNA，tRNA在蛋白质合成中具有重要作用。tRNA是特异性识别信使RNA(messenger RNA,mRNA)密码子并在翻译过程中将带电荷的氨基酸转移到核糖体中的关键衔接子。当前的热点RNA分子包括长链非编码RNA、微RNA(microRNA，miRNA)和环状RNA，但TRF通常被忽视。近年来TRF不同生物学功能的重要性逐渐受到关注。与miRNA相同，TRF在各种生物体的组织和细胞中均较丰富。TRF已被公认为是一种具有多功能的动态调节因子，能够发挥独特而多样的生物学作用[2]，在基因表达调控、翻译调控、病毒感染、癌症和神经变性方面均发挥了重要作用。现就TRF的生物学功能及其分子机制进行综述。

1 TRF的概念及来源

根据前体或成熟tRNA转录体的切割位点不同，tRNA衍生的小RNA(tRNA-derived small RNAs，tsRNA)分为两种主要类型：一种是在成熟tRNA的反密码子环中的特异性切割产生的长度为28～36 nts的tRNA片段，被命名为tiRNA；另一种来源于成熟或初级tRNA的长度为14～30 nts的片段，命名为TRF。到目前为止已鉴定出5-TRF、3-TRF、1-TRF和2-TRF 4种类型的TRF。5-TRF是由Dicer在tRNA的D-环切割生成的产物，通常以腺嘌呤为3′端进一步分为5a-TRF、5b-TRF和5c-TRF[3]。3-TRF由Dicer、ANG或Ribonucases A超家族的其他成员在T-环上切割生成，通常包含一个CCA尾序列，长度约为18 nts或22 nts[4-5]。RNaseZ核酸内切酶或其elaC同系物2对tRNA前的3′-尾片段进行切割产生1-TRF，其起始于成熟tRNA的3′端，并在3′端具有多聚-U。近年来在乳腺癌细胞中发现了一种新的含反密码子环的TRF亚型，被称为2-TRF[6]。人类细胞中5-TRF主要存在于细胞核，而3-TRF和1-TRF主要存在于细胞质[7]。

2 TRF的功能

2.1调节mRNA稳定性 作为一种长度小于30 nts的非编码小RNA，TRF与miRNA具有相似的功能，可以直接与mRNA结合，抑制蛋白翻译或切割部分互补靶点。3-TRF和1-TRF通过与AGO(Argonaute)家族蛋白竞争性结合调控基因表达，从而影响靶基因的沉默效率。此外，2-TRF或其类似物还能替换肿瘤基因mRNA结合蛋白YBX1，阻断其与致癌mRNA的相互作用使许多促癌基因mRNA不稳定，从而导致癌细胞的浸润性被显著抑制[8]。TRF的内源性mRNA靶点需要进一步研究，从而明确TRF的调控机制。

2.2抑制蛋白质的生物合成 TRF(主要为5-TRF)可使翻译速度降低10%～15%[8]。特异性的5-TRF可组装成G-四重链样结构，能竞争性地与翻译起始复合物真核起始因子4G和真核起始因子4A结合，直接影响蛋白质的翻译过程，不抑制负责细胞存活和抗凋亡的内部核糖体进入位点介导的蛋白的翻译[9]。负责细胞存活和抗凋亡的蛋白质是通过内部核糖体进入位点途径翻译的，TRF在应激条件下通过选择性地抑制某些蛋白质的翻译来减少细胞能量消耗，同时使有利于生存的蛋白质的产生不受影响[10]。这些结果表明TRF的产生不是为了降低功能成熟的tRNA水平，而是为了调节应激条件下蛋白质的翻译过程。此外，5-TRF还可以与翻译沉默子YBX1结合，并通过eIF2α蛋白磷酸化独立途径增强应激颗粒的组装，从而加强细胞对压力的抵抗能力并促进生存[11]。TRF可作为多体组装的分子制动器，从而产生平移抑制[12]。5-TRF能抑制报告基因的表达而不需要与mRNA中的互补位点结合，预示着TRF可能以翻译机制为靶点。从tRNA中提取的5-TRF已被证明与mRNA通道附近的小核糖体亚基结合，并结合DIM蛋白参与生物的合成[13]。综上所述，TRF能够通过影响翻译机制来抑制蛋白质的生物合成。

2.3调节核糖体生物的发生 TRF是核糖体生物发生的重要调节因子，包括调节核糖体RNA(ribosome RNA,rRNA)的合成、加工和核糖体亚单位的装配等过程。在低等生物中(如嗜热四膜虫)，TRF是其rRNA前体剪接复合物的组成部分。3-TRF可与Twi12蛋白(AGO/Piwi家族蛋白)特异结合，从而诱导Tan1(Twi-associated novel 1)蛋白和核酸外切酶Xrn2形成pre-rRNA剪切复合物，切割和加工前体rRNA并促进rRNA合成[14]。然而TRF是否能促进高等生物体的rRNA过程还有待进一步研究。在哺乳动物细胞中，来源于tRNA的3-TRF可与核糖体蛋白mRNA结合，促进其翻译过程[15]。综上所述，TRF可根据其亚型、细胞状态和物种在不同的水平上调节翻译调节核糖体的生物发生。

2.4作为一种新的表观遗传因子 在表观遗传学中，大部分表观遗传标记被抹去然后重新建立，基因组自我保护的机制目前仍不明确[16]。研究发现,不同长度的3-TRF(18 nts和22 nts)分别通过阻断反转录(18 nts 3-TRF)和miRNA样转录后沉默(22 nts 3-TRF)，使长端重复序列的反转录转座子沉默，进而参与调控基因组的稳定性[17]。tiRNA是小鼠成熟精子中最丰富的小RNA，受精时精子tiRNA可以改变早期胚胎的转录，包括与代谢途径相关的基因[18]。这些变化与DNA甲基化状态无关，表明调节精子的TRF可能是一种新的表观遗传因子并影响后代的表型。但TRF在体内的确切作用机制可能更为复杂，值得深入研究。

2.5引导调控RNA的反转录 TRF可作为病毒RNA逆转录中的指导RNA。宿主细胞的3-TRF(称为TRF-3019)可与人T细胞白血病病毒1型RNA的引物结合位点结合，启动逆转录从而促进病毒自合成。同时呼吸道合胞病毒的感染可通过诱导tRNA的血管紧张素裂解而产生TRF，从而引起宿主细胞的应激反应[19]。呼吸道合胞病毒利用宿主TRF作为引物促进其复制提高感染效率。因此，这两种类型的tiRNA可以作为引物进行反转录[20-21]。进一步研究TRF在病毒感染中的作用能为深入了解病毒与宿主之间的相互作用提供更有价值的见解。

2.6结合细胞色素C抑制细胞凋亡 研究表明，成熟的tRNA分子可以与细胞色素C结合，进而抑制凋亡小体的形成和胱天蛋白酶-9的活性，从而促进细胞的存活[22]。由于TRF来源于tiRNA，推测tRNA在高渗条件下也可能与细胞色素C相互作用[23]。血管紧张素介导的tiRNA(5-TRF和3-TRF)可能与线粒体释放的细胞色素C相互作用，从而抑制凋亡小体的形成和活性。TRF与细胞色素C相互作用触发了一系列抑制凋亡的生物学过程，被认为是一种新的抗凋亡机制。然而在这一生物过程中，TRF如何特异性地识别细胞色素C，是否涉及自己的修改或其他因素，在哪些特定条件下可与细胞色素C相互作用均需要进一步研究。

2.7免疫调节 TRF存在于造血细胞、淋巴组织和血液循环系统。急性炎症期，循环系统TRF水平迅速升高，表明TRF可能在免疫应答中起重要作用[24]：一方面，TRF参与免疫细胞内的基因调控，在单核细胞成熟为树突状细胞期间，来自tRNA的5-TRF可与AGO样蛋白家族中PIWIL4和PIWIL1蛋白形成复合物，然后募集SETDB1、SUV39H1和HP1β以甲基化CD1A分子，启动子区域上的组蛋白H3K9，导致CD1A表达的抑制[25]；另一方面TRF可直接与Toll样受体相互作用，激活Th1细胞和毒性T淋巴细胞的免疫应答[26]。这些结果显示，TRF可作为一种新的免疫信号分子参与免疫调节，但详细作用机制有待进一步研究。

3 TRF在肿瘤中的作用

肿瘤细胞生长迅速，血液供应不足导致微环境中氧气和营养缺乏。肿瘤细胞可以通过不同的调控策略来适应这种环境，从而确保其生存和增殖[27]。tRNA可在缺氧缺血环境下产生TRF，并且TRF可以保护细胞在应激条件下的存活。近年来，TRF已成为肿瘤治疗的研究热点。此外肿瘤患者的尿液和血清中可检测到TRF，其有望成为肿瘤诊断的新的分子标志物[28]。

3.1乳腺癌 乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤，TRF与乳腺癌的发生、进展有密切关系。TRF通过取代RNA结合蛋白YBX1中的3′非翻译区来抑制乳腺癌细胞中多种致癌基因的稳定性，从而抑制肿瘤细胞的转移和扩散[29-30]。因此，TRF可作为肿瘤治疗的新诊断指标和治疗靶点。通过高通量测序分析发现乳腺癌患者血液中TRF水平与其病理特征密切相关。乳腺癌细胞和未分化的乳腺上皮细胞中TRF表达上调，而转移性高的乳腺癌细胞中未发现TRF表达，表明TRF在乳腺癌进展中有潜在作用[31]。研究发现，乳腺癌细胞在缺氧刺激条件下TRF水平显著上调[32]。通过基因本体论和通路分析表明，上调的TRF主要参与维持干细胞群和细胞对白细胞介素-6的反应，这可能是缺氧诱导的TRF促进三阴性乳腺癌中阿霉素耐药的潜在机制。同时，在曲妥珠单抗耐药的细胞中也验证了这一结论。Sun等[29]使用高通量测序检测了正常乳腺上皮细胞系，曲妥珠单抗敏感和抗性乳腺癌细胞系中TRF的表达水平，结果显示TRF在HBL-100、SKBR3和JIMT-1细胞系中差异表达。与敏感个体相比，在曲妥珠单抗耐药患者中TRF-30和TRF-27显著上调，并且受试者工作特征曲线分析显示TRF-30和TRF-27与曲妥珠单抗抗性相关；在多变量分析中，较高水平的TRF-30和TRF-27表达与转移性人表皮生长因子受体阳性乳腺癌患者的无进展生存期显著缩短相关，表明TRF-30和TRF-27在曲妥珠单抗抗性中起重要作用[33]。因此，TRF可作为潜在的生物标志物和干预靶点来指导耐药性乳腺癌的临床诊断和治疗。

3.2前列腺癌 前列腺癌是发达国家男性中最常见的癌症。虽然它的遗传背景已被深入研究，但对于TRF在这种疾病中的作用仍不明确。由于缺乏可靠的疾病预后标志物导致不恰当的患者分层，过度治疗以及由前列腺切除术和放疗后引起的不良反应使前列腺癌的治疗受到阻碍，因此需要更好地了解前列腺癌发病和进展的分子机制，以发现更好的标志物并开发新的治疗策略。Sun等[29]用RNA测序方法分析了来自前列腺癌旁细胞和不同分期的肿瘤细胞，发现了598个独特的TRF，其中大多数TRF来自成熟的细胞胞质tRNA的5′端和3′端；tRNA的其他部分产生的TRF，包括tRNA的前拖尾和先导，以及线粒体tRNA产生的TRF。基于片段起源的成熟tRNA部分，可以区分5种不同的TRF类别。其中，5e-TRFs类是最丰富的，包含最多的独特TRF。鉴于5′衍生的TRF在抑制蛋白质合成中的作用及其在应激颗粒(应激颗粒是一种应激诱导的细胞质灶，具有高度集中的非翻译信使核糖体微粒)组装中的作用，这将有利于鉴定上调的5′衍生的TRF，测试它们抑制翻译的能力以及在前列腺癌细胞系中体外诱导应激颗粒的组装。研究表明，应激颗粒可能通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1-过度活化诱导的细胞凋亡的负调节在癌症中发挥重要作用，因此TRF在应力颗粒装配中起重要作用,表明TRF的上调可能与癌细胞中细胞凋亡的抑制间接相关[34]。TRF在肿瘤细胞中的特异性高表达预示着TRF可作为前列腺癌无进展生存和良好预后的指标，为进一步研究TRF在前列腺癌中的生物标志物潜力和功能奠定了基础。

3.3结直肠癌 结肠直肠癌是最致命的疾病之一，也是癌症相关死亡的第三大原因，是一种由遗传和表观遗传改变引起的疾病[35]。40%～50%的人类结直肠癌病例在诊断时出现转移或在治疗后发生远处复发，转移性结直肠癌的中位总生存期不到2年[36]。因此，需要新的诊断标志物和治疗靶标。研究发现，TRF/miR-1280可通过抑制JAG2(Jagged 2)蛋白支持的干细胞样表型，显著抑制大肠癌细胞的存活和转移相关特征[37]。TRF/miR-1280在结直肠癌细胞中过表达或JAG2基因敲除显著抑制干细胞样表型标记CD133，减少乳突球的数量和大小,从而抑制癌细胞的生长[38]。此外,TRF/miR-1280在结直肠癌细胞中的过表达和JAG2基因敲除也能抑制大肠癌细胞的迁移[39]。TRF/miR-1280可以通过靶向JAG2直接抑制Notch信号转导，导致Notch途径组分和Notch信号转导的活性降低。这些结果可以解释为非编码RNA片段驱动的异常Notch信号转导激活与癌症起始和进展分子相关，包括结直肠癌中癌细胞的增殖和耐药性。因此，TRF/miR-1280被认为是结肠直肠癌细胞中Notch信号转导和上皮-间充质转化的强大主要调节因子，将TRF/miR-1280引入肿瘤细胞的研究中可能是一种逆转肿瘤进展的新方法。

4 展 望

TRF在基因表达调控，翻译调控，病毒感染，癌症和神经变性方面均发挥重要作用。目前大多数TRF生物学功能和生物学起源尚不清楚。因此，明确tRNA中修饰碱基具体机制有利于更深入地研究TRF的生物发生。基于TRF非侵入性生物标志物的应用将在疾病诊断方面有广阔的应用前景。目前对TRF的相关研究还处于初级阶段，但TRF已经引起了越来越多研究者的关注。随着高通量测序技术和新一代测序技术的发展，TRF将得到深入研究，并可能成为肿瘤分子诊断的特异性生物标志物，为临床诊断和筛查早期肿瘤提供一种无创、安全、可靠的治疗手段。