金属硫蛋白在肺动脉高压形成中的机制研究进展

李子广，黄礼年

(1.蚌埠医学院第二附属医院呼吸内科，安徽 蚌埠 233003；2.蚌埠医学院第一附属医院呼吸与危重症医学科，安徽 蚌埠233000)

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是由多种因素导致肺血管受累引起肺循环阻力和压力进行性增高，最终导致右心功能不全的一大类疾病。目前采用于海平面、静息状态时、右心导管法检查肺动脉收缩压>30 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和(或)肺动脉平均压>25 mmHg，或者运动时肺动脉平均压>30 mmHg，并且肺毛细血管楔压≤15 mmHg 为PAH的诊断标准[1-2]。引起PAH的常见病因包括遗传、缺氧、基因变异、血栓栓塞、左心疾病等多种因素[3-4]。PAH的病理生理包括肺动脉平滑肌细胞过度增殖、肺动脉内皮细胞凋亡、减少血管舒张以及增加血管收缩等启动一系列的肺血管改变(包括内膜增厚和血管壁向心性肥大)，从而使肺小动脉闭塞，并使肺动脉压升高[5]。目前PAH的治疗药物包括内皮素受体拮抗剂、前列环素类似物和一氧化氮扩张剂。然而，目前促进PAH发生的确切机制尚不明确，因此，寻找新的形成PAH的作用靶点更为迫切。金属硫蛋白(metalthioneins，MTs)在一些疾病模型中被证明可调节细胞增殖和血管收缩[6]。现就MTs在PAH形成机制中的研究进展予以综述。

1 MTs概述

MTs是存在于细菌、植物、无脊椎动物和脊椎动物中的低相对分子质量的细胞质蛋白。哺乳动物有4种MT亚型(MT-1、MT-2、MT-3和MT-4)。MT-1和MT-2存在于软组织(特别是呼吸系统)；MT-3表达于脑组织、心脏、肾脏和生殖器官，而MT-4存在于口腔上皮、食管、胃、足垫和新生儿皮肤中[7]。在细胞内，MTs的功能作用通过铜/锌解毒和维持金属离子稳态实现，参与多个细胞过程[8]。MTs还可调节细胞中的凋亡途径，并通过胱天蛋白酶-3和p38促分裂原活化的蛋白激酶介导[9]。MTs在细胞内环境中具有多种功能作用，有助于调节关键的细胞过程和细胞内稳态[10]。

2 MTs在PAH形成中的相关作用

2.1氧化应激与抗氧化作用 氧化应激被认为是PAH进展和严重程度的生物标志物[11]，MTs通过其半胱氨酸残基的硫醇基团与重金属结合，参与金属调控过程。MTs对重金属有很高的亲和力，与金属结合，提供对金属毒性，特别是镉毒性的保护。当MTs与锌和铜等生理重金属结合时，参与调节细胞生长和增殖，保护机体免受氧化应激；血管重构和血管收缩剂的产生增加，肺动脉平滑肌细胞钙离子(Ca2+)水平升高，收缩装置对Ca2+的敏感性增强；信号通路的激活和对肺动脉平滑肌细胞肌球蛋白轻链磷酸酶的抑制，在慢性缺氧相关的血管收缩中起着重要作用[12]。黄嘌呤氧化酶和线粒体[13]是与PAH发展相关活性氧类的主要来源，在PAH中也起着重要作用，因为氧化应激可以降低细胞的功能[14]。在慢性缺氧大鼠中，减少右心室肥大对缺氧相关PAH的发生有重要作用，同样，抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸也可减弱慢性缺氧诱导的PAH[15]。另外，慢性低氧可增加心肌中膜肌化和超氧化物歧化酶水平，研究表明，在慢性低氧和低氧/SU5416治疗大鼠中，与单纯缺氧相比，缺氧/SU5416暴露通过超氧化物歧化酶和Rho激酶依赖的Ca2+敏化机制，导致更严重的PAH、右心室肥厚、外膜病变形成和更高的血管收缩敏感性，另外，低氧组和低氧/SU5416组均能降低右心室收缩压，且活性氧类在介导慢性缺氧和缺氧/SU5416模型大鼠血管收缩反应性和PAH中具有重要作用[16]；由于这些原因，有研究在不同的PAH模型中测试了抗氧化疗法的有效性[17]，包括抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸和褪黑激素[18]。氧化应激可导致含锌蛋白中锌的释放，并诱导MTs在多种组织中的表达，在肝组织中，氧化应激诱导MTs的表达，这可能意味着MTs的表达作为一种表观现象与氧化应激的升高平行；MTs通过调节线粒体环境来限制氧自由基的产生，其机制可能为MTs通过调节线粒体复合体活性和呼吸，从而提高线粒体偶合效率，限制氧自由基的产生[19]。因此，作为对氧自由基的一种自然反应，细胞可以增加MTs的表达。这些细胞MTs使线粒体复合物更有效地传递电子，限制了过量的氧自由基的产生，并具有抗氧化作用。因此，可以通过研究MTs抑制剂对PAH模型中氧自由基水平的影响来降低PAH的形成。

2.2血管细胞增殖和血管增生 在PAH中，肺动脉内皮细胞和肺动脉平滑肌细胞增殖以及小血管增生是肺血管重构的重要因素。研究表明，PAH大鼠的血管增生和人类肺微血管内皮细胞增殖依赖于铜的促血管生成作用[20]。铜转运蛋白1和赖氨酰氧化酶的表达及活性在PAH小鼠的肺动脉中被上调，这些小鼠表现出明显的肺血管重构，铜转运蛋白1的参与证实了铜依赖血管细胞增殖和血管增生[21]。这些发现支持铜螯合蛋白的作用。此外，内皮过度增殖是PAH的一个显著特征[22]。在其他疾病模型中，MTs表现出铜的螯合特性和抑制细胞增殖的能力[23]。因此，MTs在调节非病理性细胞增殖方面起着重要作用。转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)可诱导肺动脉内皮细胞和肺动脉平滑肌细胞增殖，促使PAH形成。Hopper等[24]的研究表明，血管细胞的增殖由机械敏感受体的激活引起，使增殖基因和TGF-β的活性增加，提示TGF-β在PAH中升高。另一方面，高浓度的TGF-β可抑制MTs[25]。可见，MTs在TGF-β相关增殖中的作用与PAH密切相关，因此MTs可能参与PAH的病理生理过程。而TGF-β抑制剂能否降低PAH模型中MTs的表达和细胞增殖是值得研究的问题。

2.3缺氧性肺血管收缩 肺长期暴露于缺氧，缺氧引起血管收缩和PAH。在缺氧等应激条件下，MT-1/2对血管生成和对照生成的刺激作用也被提出，MT-1/2蛋白水平升高可稳定缺氧诱导因子-1α的表达；另外，MT-1/2可诱导成纤维细胞生长因子、TGF-β和血管内皮生长因子A等促血管生成因子的表达[26]。研究表明，肺血管收缩是通过过量产生的氧自由基和锌介导，低氧刺激线粒体产生活性氧类，并刺激肌质网钙释放和血管收缩，在缺氧反应中，锌激活钾通道并使肺动脉平滑肌细胞膜超极化[27]。这与锌转运体的表达增加相一致，并促进肺动脉平滑肌细胞的增殖和血管收缩。MTs是PAH中活性氧自由基家族生成的重要媒介。MTs基因功能的丧失和获得分别阻断和增强了血管的重构调节，活性氧类的产生和氧化应激可导致肺动脉的重构，这也是持续性酸碱度发展的主要因素；线粒体产生的活性氧类与氮氧化物产生活性氧的正反馈系统有关，活性氧类自由基的增加可导致细胞一氧化氮浓度的降低，这不仅可能导致血管内皮功能障碍，也可能参与PAH发展的血管重构；由氧自由基激活Ca2+通道的下游信号，导致Ca2+从肌质网中释放，致使肺动脉血管收缩[28]。Jernigan等[16]的研究结果也支持氧自由基的生成在调节缺氧的肺动脉血管收缩和酸碱度方面具有重要作用。成纤维细胞的增殖和迁移可促进与肺血管收缩相关的血管重构，最终导致肺血管重构。成纤维细胞参与肺血管重构的原因是氮氧化物活性增加，然而，MTs在缺氧引起的肺血管收缩或PAH模型中的作用少见报道。

2.4线粒体动力学、基因/蛋白质变化与功能障碍 线粒体动力学包括一系列调节的细胞反应，改变线粒体的形状和大小及线粒体的基因/蛋白质，致使线粒体分裂上调，融合下调。线粒体代谢和氧化应激的变化可能决定了线粒体动力学和MT表达的调节。MT-1/2在各种细胞过程中起着重要作用，MT-1/2调节锌离子稳态，因此可能调节许多转录因子或锌依赖酶的活性。研究表明，MT-1/2在增殖细胞中的定位取决于细胞周期的阶段，并在细胞核中观察到，在静止细胞中，MT的异构体主要局限于细胞质，在G1期，细胞质中的MT-1/2浓度最高，而在G1/S期，可以观察到MT-1/2分子向细胞核易位[26]。此外，在细胞周期的S和G2阶段检测到最高浓度的MT-1/2分子，这突出了它们在细胞分裂中的作用[29]。研究表明，PAH中线粒体动力蛋白相关蛋白-1的磷酸化状态改变，导致线粒体分裂，促使肺动脉平滑肌细胞增殖，导致线粒体基因/蛋白的变化，增加了线粒体碎片，造成了增殖和凋亡之间的不平衡，并促进了肺动脉平滑肌细胞的增殖[30]。缺氧诱导因子-1通过调节细胞代谢、增殖、存活、红细胞生成和血管生成来适应低氧[31]，说明线粒体动力学和基因/蛋白改变在PAH病理生理中的重要性。研究还表明，MTs影响过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α、核转录因子1/2以及线粒体转录因子A的基因表达[32]。表明MTs在线粒体基因/蛋白改变中起一定作用，如果在PAH模型中发现细胞MTs参与线粒体基因/蛋白的变化，那么未来的研究将为PAH的病理生理提供新的见解。PAH与线粒体功能障碍之间的联系已有报道，在各种PAH模型中均观察到线粒体功能障碍[33]。因此，研究细胞MTs在PAH相关线粒体功能障碍中的作用，对PAH的研究具有重要意义，不仅可揭示MTs在PAH相关线粒体功能障碍中的作用，而且可以描述MTs的参与对PAH病理生理的影响。

2.5MTs基因多态性与细胞凋亡 MTs在正常肺细胞、支气管上皮细胞和癌细胞的细胞质和细胞核中表达，MT-1/2可保护肺组织免受细菌内毒素、臭氧、卡莫司汀(脂溶性高肺毒性烷基化剂)、卵清蛋白和镉等有毒金属离子的破坏[34]。在人气道上皮细胞中，镍通过动员细胞内游离锌水平来增加MT-2A信使RNA的表达[35]。多个MTs基因在PAH患者的肺中上调，但它们在PAH中的确切作用仍存在争议。MT-1、MT-2A和MT-3表达增强可减轻肺损伤，而MT基因剔除小鼠缺氧后肺血管收缩较轻[36]。提示MTs可能在缺氧等应激条件下对血管生成和侧支生成的刺激作用，意味着应激源可以调节MT的表达。高水平的肺脂质过氧化物表明氧化应激可能是脂多糖治疗的MT-1/2缺陷小鼠肺部的重要损伤因子[37]。在接受臭氧处理的MT-1/2剔除小鼠中也观察到了肺超微结构和氧化应激相关分子的变化，与对照组相比，MT-1/2剔除小鼠肺组织中血红素加氧酶1、诱导型一氧化氮合酶、8-羟基-2′-脱氧鸟苷和硝基酪氨酸等氧化应激相关分子的表达显著增高[38]；尽管臭氧和脂多糖暴露对MT-1/2缺陷小鼠的肺损伤更严重，但在这两项研究中均未观察到支气管肺泡灌洗中促炎细胞因子表达水平的变化[39]。然而，与野生型对照组相比，卵清蛋白治疗导致MT-1/2剔除小鼠肺部白细胞介素-1b水平显著升高；在PAH的实验模型中，MT的表达和活性可能根据疾病的严重程度而增加或降低[38]。因此，有必要对MTs在PAH中的表达/活性进行全面的研究和探讨。有研究分析MTs在肺癌中的表达与临床病理数据的关系，结果发现，与正常上皮性气道细胞相比，非小细胞肺癌细胞的MT-1/2水平持续升高[40]。此外，对肺癌患者中MT-1/2蛋白表达的分析表明，MT-1/2蛋白只存在于非小细胞肺癌细胞、鳞状细胞癌和腺癌中，而在小细胞肺癌中无MT-1/2蛋白[41]。癌细胞中MT-1/2免疫反应性与肿瘤恶性程度、原发性大小、淋巴结受累或坏死无关，但值得注意的是，MT-1/2免疫反应性的增加与恶性肿瘤分级的增加平行[42]。然而，另有研究表明，MT-2A的表达增加与乳腺癌组织的增殖有关，表明MTs可能具有与PAH相关的有益影响，而其他MTs如果在PAH中过度表达，则可能产生有害影响[43]。因此，还需要通过更多的研究，明确PAH的病理生理过程中各种MTs在自然细胞反应中的作用。MT-1/MT-2基因剔除小鼠对阿霉素诱导的心脏疾病具有天然的保护作用，而心脏特异性MT-2A过表达的小鼠对糖尿病引起的心脏疾病具有抵抗力[44]。在上述研究中，MT的心脏保护作用是由于MT的抗炎、抗氧化作用。MTs在不同的器官中表达，不同MTs在心和肺中可能有不同的作用，这一点在研究MTs作为PAH的潜在药物靶点或在PAH模型中作为心脏保护的药物靶点时是必不可少的。有文献表明，MTs可用于临床治疗各种疾病[45]，主要是因为MTs可以作为氧化还原代谢改变的生物标志物和治疗药物靶点[46]。因此，Sharma等[47]认为，MTs是最受欢迎的分子，可用于细胞疗法和纳米技术的发展。

3 小 结

PAH是一种危及生命的罕见疾病，进展迅速，目前尚无治愈方法。治疗的目的是通过靶向调节前列环素、内皮素或一氧化氮途径来减缓疾病进展和减轻临床症状。以往的经典途径为药物通过扩张血管、抗增殖和抗炎降低PAH，但往往使用不足，与药物相关的不良反应、无法达到靶向治疗相关。MTs与PAH发展过程密切相关，在基础研究、体外实验及临床试验中，MTs通过细胞的氧化应激和肺血管平滑肌细胞的增殖以及线粒体动力相关蛋白的磷酸化参与PAH的形成，虽然取得了一定进展，但MTs参与PAH形成的相关细胞信号通路仍不明确，在临床实践中还有很长的路要走，需要进行更多的流行病学及多中心的临床研究。