卵胞浆内单精子显微注射技术对子代表观遗传学的影响

王楠，倪俊学，转黎

(1.昆明理工大学医学院，昆明 650051；2.云南省第一人民医院 a.儿科，b.生殖医学科，昆明 650032)

近年来，男性不育患者的数量逐年上升，大多数表现为少精子症、弱精子症、畸形精子症、死精子症及无精子症等，若治疗不当可造成终生不育，影响家庭和睦，不利于提升我国生育质量。随着辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)水平的提升，很多不孕不育的家庭选择ART完成生育。其中卵胞浆内单精子显微注射技术(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)具有不受精子数量和形态影响、受精率高等优点，成为临床上治疗男性不育症的重要方法之一，也是目前治疗男性不育最有效的技术[1]。虽然临床上ICSI的应用比较成功，但ICSI出生子代的安全性问题引起人们的关注，成为全球医源性健康问题之一。为了研究ICSI对ICSI子代表观遗传学的影响及其是否增加ICSI子代出生缺陷风险，进一步深入调查研究发现，部分运用ART出生的子代患有印迹基因错误、先天畸形、出生低体重等表观遗传学现象异常，其中也包括表观遗传缺陷所导致的一些遗传疾病[2-3]。有研究表明，临床上运用ART的新鲜或冷冻胚胎的子代出生缺陷的风险较高，但仍需更多研究来阐明运用体外受精技术(in vitro fertilization，IVF)和ICSI后新鲜或冷冻胚胎周期对子代出生缺陷的影响[4]。另有研究表明，ART中ICSI子代出生缺陷率与常规IVF子代出生缺陷率相似，但均高于自然妊娠子代出生缺陷率[5-6]。其中，ICSI是否引起子代出生缺陷已成为临床研究的主要问题。虽然已有研究表明，如果胚胎植入前不进行遗传学筛选，采用ICSI的精子在运行过程中一旦发生不完全表观遗传修饰，就会使出生子代的遗传表型发生异常[7]。但是，关于人类表观遗传变化导致的胚胎发育不良、胎盘功能障碍和出生缺陷到底是由ICSI引起的还是父母中已存在的医学或遗传条件的后果，仍存在争论。探究ICSI对子代出生缺陷的影响以及对出生子代表观遗传学具体存在哪些方面影响的意义有助于探讨ICSI出生子代相关基因、微RNA表达水平与出生缺陷之间的相关性，更有助于为ICSI子代出生缺陷机制与子代表观遗传学现象探索寻找证据。现对ICSI对其子代表观遗传学的影响进行综述。

1 ICSI概述

ICSI主要针对严重少精、弱精、无精、畸形精子症男性患者，由于精子数量过少或精子形态功能缺陷而不能正常穿透卵母细胞透明带，无法完成受精过程或受精率下降。其中，对于无精子症的患者，通过手术从附睾或睾丸中获取精子进行ICSI可能是唯一的治疗方法[8]。ICSI不仅包括配子与胚胎体外培养过程，还需借助显微注射仪操作系统将筛选出的优质单一精子注射入单一卵细胞内实现受精，虽然对卵子的伤害最低，但却干扰了配子发生、胚胎发育甚至整个妊娠过程的大环境，在卵子MⅡ期干扰了正常的受精过程和植入前胚胎的发育过程，并且ICSI在显微操作过程中将外源性物质注入卵母细胞质内，破坏了卵子和纺锤体等结构，这些操作均可能对配子的受精和后续胚胎的分化及发育产生影响[9]。

一项动物研究表明，在卵母细胞中，表观遗传印迹是在原始卵泡向腔内卵泡转化过程中建立的，直到排卵前印迹模式才能完全确定某些基因，因此体外环境的改变可能导致子代表观遗传修饰异常[10]。ICSI可能诱发胚胎表观遗传畸变、影响ICSI受孕儿童的发育，为未来更好地改进和完善ICSI提供了方向。

2 子代表观遗传学概述

表观遗传学是指在不涉及基因的核苷酸序列改变的情况下，基因表达水平和功能发生改变，最终使子代表型发生变化，表观遗传学现象的性状和特征可以直接观察到，由环境与基因型共同决定[11]。表观遗传修饰异常可能在形成配子、受精和早期胚胎发育过程中发生，因此在不改变DNA序列的情况下生物学和环境因素可以影响后代的表观遗传重新编程[12]。表观遗传编码程序分为三个阶段，第一阶段发生于原始生殖细胞中，涉及全基因组去甲基化；第二阶段建立新的甲基化模式；最后一个阶段在胚胎发生早期，通过某些基因的主动去甲基化和被动去甲基化来实现。表观遗传重新编程涉及多个相互依赖的调节机制，如共价组蛋白修饰、染色质重塑、DNA甲基化和非编码RNA等，因此，配子和胚胎在体外暴露于人工条件和非生理介质时可能会导致表观遗传突变[13]。有证据表明，甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化是组蛋白对基因调控的主要方式[14]。印迹是表观遗传学基因调控的一种形式，当有不同的等位基因表达时，这种基因的表达取决于亲本的性别，而不改变其潜在的DNA序列在配子发生和植入前发育过程中，印迹调节的改变会破坏正常的生长发育，导致印迹紊乱。研究发现有100多个已知的印迹基因，并且不适当的表观遗传调控可能导致基因表达异常或表型改变，但医学文献中仅描述了9种经典印迹障碍，而表观遗传学的分子机制发生在转录前和转录后，主要与DNA、RNA和组蛋白相关[10]。ICSI是治疗男性不育的有效方法之一，但是在克服精子数量、活力、形态异常引起的受精障碍的同时也跨越了机体的自然选择机制，使存在表观遗传学异常的精子与卵子受精结合，导致出生子代携有同样表观遗传学异常的风险升高。因此，可通过研究ICSI对表观遗传学调控机制的影响，从而确定ICSI具体对子代表观遗传学有哪些方面影响，为ICSI出生子代生殖遗传安全性的评估提供科学、有效的遗传学数据。

3 ICSI对子代表观遗传学的影响

3.1印迹基因位点甲基化异常 目前，ART相关表观遗传学研究主要集中于基因选择性转录表达调控，包括DNA甲基化和组蛋白修饰等，以印迹位点甲基化异常的研究最丰富。人类妊娠后10～11周，原始生殖细胞甲基化水平降到最低，而后进入甲基化重编程[15]。印迹基因位点甲基化一般发生于配子形成期，印迹基因的缺失会导致其雄配子基因组不能在成熟卵母细胞中获得相应的印迹基因，两次DNA甲基化重编程过程中任一环节出现问题都可使胚胎发育异常，导致遗传疾病的发生，使子代缺陷的患病率升高[11]。如钾离子通道蛋白家族印迹调控区和小核核糖核蛋白多肽N基因印迹调控区的异常低甲基化分别导致了贝-威综合征和天使综合征[16]。不育症男性患者的某些精子含有错误的印迹基因，选中此类精子会增加子代遗传的风险[17]。在小胎龄婴儿中印迹丢失和表观遗传标记改变，与自然妊娠子代相比，IVF与ICSI子代胎盘的DNA甲基化模式和基因表达谱发生了改变[18]。在97例不育男性检查中发现印迹基因GTL 2(gene trap locus 2)和h19发生紊乱，表明男性不育与精子中印迹位点甲基化异常相关[19-20]。无生育能力患者的印迹基因胰岛素样生长因子Ⅱ/H19印迹控制区1(imprinting control region 1，ICR 1)低甲基化，发现精子数量低与印迹基因胰岛素样生长因子Ⅱ、H19 ICR 1低甲基化有关[21]。若ICSI注入的精子呈圆形或长形时可能为印迹不完全的配子，这也会增加子代发生印迹基因缺陷的风险，一些少精子症患者精子中存在的印迹位点甲基化异常现象也可遗传给子代[22]。研究显示精子质量越差，印迹位点的甲基化改变越明显[23-24]。约40%子代DNA甲基化异常与其父本精子的异常相同[25-26]。因此，印迹基因位点甲基化异常亲本进行ICSI可使子代携带同样缺陷的概率升高。ICSI还可增加印迹疾病的发生率，并可通过未成熟的精子建立适当的印迹或甲基化异常而对胚胎的发育产生不利影响，因此筛选印迹基因位点甲基化精子可作为精子质量评估的生物学标志之一[27]，也是选择表观遗传合格的精子运行ART降低世代之间遗传风险的有效方法。因此，临床上运用ART时应先进行遗传诊断筛选，避免携带有印迹基因位点甲基化异常的精子与卵子受精结合，降低出生子代发生印迹基因缺陷或印迹疾病的风险。

3.2子代先天畸形 陆续有大规模的流行病学研究发现ICSI出生子代存在出生缺陷的风险高于正常妊娠子代，且ICSI在胚胎体外培养过程中由于环境改变使父系DNA损伤导致精子永久遗传或表观遗传改变，这种改变可以传给子代，造成子代先天畸形[28]。临床上，ART子代出现先天畸形的案例也有很多。有研究发现，ICSI多胎妊娠婴儿的先天性畸形风险显著高于自然妊娠婴儿，如唇裂或腭裂、眼睛、耳朵、面部和颈部、呼吸、肌肉骨骼、神经和消化系统畸形[29-30]。采用ART出生子代的视觉功能和眼部形态由于水平和质量低，尚无定论。对采用不同ART的648例新生儿进行数据统计分析发现，10例患有疾病，ICSI组中性逆转1例、唇腭裂2例；IVF组先天性心脏病、血管瘤、肾积水和睾丸鞘膜积液各1例；供精人工授精组先天性心脏病3例[31]。IVF和ICSI还可增加出生子代多指的发生风险，与手多指有关[32]。近年来较多临床研究数据发现ICSI子代发生先天畸形的概率不断增加，因此除了在运行ICSI之前需进行遗传诊断筛选外，更要在进行ICSI体外培养时保护好环境，降低ICSI子代先天畸形的发生率。同时仍需更多高质量研究对ICSI治疗及出生子代先天畸形的相关内容进行评估。

3.3对子代体重的影响 出生子代体重异常也是反映ICSI对子代表观遗传学影响的重要指标之一，自然妊娠子代与ICSI子代的体重可能存在差异。在ICSI周期中，由于配子和胚胎接受人工培养基改变了激素和化学环境，从而造成DNA甲基化、表观遗传修饰等后果，并且培养基不同也可导致ICSI子代出生时的平均出生体重显著变化[33]。在运用ICSI 体外胚胎培养时对培养基的选择也需要进一步研究和认证。有研究发现，接受ART后的单胎妊娠增加了早产、高血压、产前产后出血、胎盘紊乱和出生低体重的风险，ICSI中单胎女婴的出生体重低于自然妊娠中的单胎女婴[34]。另外，ICSI子代患有代谢紊乱、心血管疾病和恶性肿瘤的风险略有增加，且存在多胎妊娠、早产和低出生体重等风险[35]。一些国家和国际出生登记的研究数据表明，IVF和ICSI孕育的单胎婴儿出现不良围生结局的风险增加[36]。因此，ICSI出生子代体重的改变和单胎婴儿不良围生结局的出现可能与父系、母系所携带的遗传基因无关，而与ICSI本身的操作与环境等相关。与自然妊娠的婴儿相比，ART子代更容易出现宫内生长受限、出生体重低、早产和围生期死亡[36]。虽然，已有一些研究证明了ICSI对子代体重的影响，但是具体的影响机制有待于研究与拓展。

4 展 望

采用ART出生的子代大部分均表现出与自发受孕儿童相同的健康水平，其中ICSI已经成为临床上治疗男性不育的首选方法，但大多数男性不育的病因尚不清楚，异常的表观遗传标记可使精子改变，甚至造成男性不育。ICSI可直接处理和选择形态合格的精子用于治疗男性不育，但也可带来较大风险，很多表观遗传现象或者疾病可通过ISCI遗传给子代使子代出现某些缺陷，因此ICSI对子代表观遗传学的影响值得被重视。在应用ICSI治疗男性不育症前进行大量临床研究与评估，按照不同年龄阶段对ICSI出生子代进行随访，统计分析ICSI对子代表观遗传学影响的程度；可以运用高通量测序对出生子代血样进行基因检测，分析ICSI是否对子代表观遗传学存在影响及其相关的影响机制。

如何提高ICSI精准化治疗和降低ICSI对子代表观遗传学的影响甚至消除，从而获得健康ICSI子代值得更深入的研究。也为ICSI出生子代缺陷发生机制探索寻找证据，为将来的子代印迹综合征、代谢综合征、癌症等治疗提供临床依据。相信随着ICSI 的不断完善与发展，可以在今后的科学研究以及临床实践等诸多领域发挥越来越重要的作用。