中医药逆转EGFR-TKIs治疗非小细胞肺癌获得性耐药研究进展

周晴晴，李慧杰，李秀荣*

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014)

根据中国2015年恶性肿瘤发病和死亡分析报告，肺癌是发病率、死亡率均居首位的恶性肿瘤[1]。约85%的肺癌患者为非小细胞肺癌(NSCLC)，而在NSCLC患者中表皮生长因子(EGFR)表达率为40%～80%[2]。近年来，分子靶向治疗成为继手术及化疗、放疗三大肿瘤经典治疗方法后的热门治疗手段，尤其是表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)的发展及应用使NSCLC的治疗取得里程碑式进展[3-4]，临床试验PIONEER研究显示，51.4%随机的亚裔晚期肺腺癌患者伴有EGFR基因敏感突变，且在不吸烟腺癌患者中该比例高达60%[5]。目前，临床上使用的EGFR-TKIs有三代，第四代EGFR-TKIs仍在研发中。三代EGFR-TKIs均表现出优于传统化疗的临床疗效，但患者在获得可观临床收益的同时，用药9～12个月后不可避免的耐药现象使EGFR-TKIs的临床应用受到极大局限[6]。既往临床及实验研究发现，中药联合EGFR-TKIs可改善患者生活质量、进一步延长患者生存期，起到减毒增效的作用，在逆转EGFR-TKIs获得性耐药方面有确切疗效。本文通过复习近10年国内外的相关文献，对不同中药提取物、中药制剂等逆转EGFR-TKIs获得性耐药的疗效和机制进行综述，以期为中医药逆转EGFR-TKIs获得性耐药提供理论依据，探讨中医药联合靶向治疗的临床优势和可行性。

1 EGFR-TKIs获得性耐药

2010年哈佛医学院Jackman等[7]将EGFR-TKIs获得性耐药准确定义为：①既往接受单药EGFR-TKIs治疗(如吉非替尼、厄洛替尼等)；②符合以下两种情况中的任意一种：携带已知与使用EGFR-TKIs治疗的药物敏感性相关或客观临床获益相关的EGFR基因突变(如19外显子缺失、L858R、G719X、L816Q)的肿瘤；③疾病在至少连续接受EGFR-TKIs治疗30天以后发生系统性进展(进展指RECIST指或 WHO评价标准)；④从停用吉非替尼或厄洛替尼到开始新的治疗之间没有介入的系统治疗。该定义相对简单明确，将患者群体中对EGFR-TKIs的获得性耐药问题趋于统一化，最大限度地减少了临床试验中假阳性和假阴性活动性信号的报告，并有助于识别真正克服获得性耐药性的药物。

第一代EGFR-TKIs以厄洛替尼、吉非替尼等药物为代表，其与ATP可逆地与酪氨酸激酶功能域竞争结合以抑制其磷酸化[8]。第二代EGFR-TKIs，如阿法替尼、达克替尼等，第三代EGFR-TKIs，如奥希替尼等可与酪氨酸激酶功能域不可逆地竞争结合抑制其磷酸化[9]。众多临床研究发现，使用EGFR-TKIs治疗的患者均在开始治疗9～12月后不可避免地出现获得性耐药[10]。60%的患者因为EGFR在T790M上的突变而产生耐药作用[11]。第一、二代EGFR-TKIs对获得性T790M耐药突变型患者尚未见可喜疗效，第三代EGFR-TKIs对此较第一、二代有更明显的临床优势[12]，但仍会再次出现耐药的情况。

目前，T790M二次突变和c-MET基因扩增是EGFR-TKIs产生获得性耐药较明确的主要机制[13]。此外还有30%～40%的EGFR-TKIs获得性耐药机制还在探索中。已报道的可能的耐药机制主要分为依赖EGFR通路和非依赖EGFR通路两类。依赖EGFR通路主要包括EGFR二次突变，非依赖EGFR通路包括人表皮生长因子受体-2(HER2)扩增、Bcl-2蛋白家族促凋亡介质(BIM)缺失、HGF/c-MET通路的激活、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)的活化、RAS突变、磷酸酶和张力蛋白类似物(PTEN)缺失、上皮-间充质转化(EMT)、p53上调的细胞凋亡调节剂(PUMA)表达下调、白细胞介素-6(IL-6)和血管内皮生长因子(VEGF)高表达等[14]。

1.1 依赖EGFR通路

依赖EGFR通路主要指EGFR二次突变，其增加了EFRR激酶功能域的ATP亲和力，使EGFR-TKIs无法有效阻断EGFR活化信号从而产生获得性耐药，包括T790M突变、C797S突变以其他罕见突变，如D716Y及T854A突变等，其中最常见的是T790M突变[15]。

1.2 非依赖EGFR通路

非依赖EGFR通路包括旁路激活、组织学转化、下游靶点激活三类途径[16]。旁路激活是指某些细胞因子活化或激酶激活的旁路途径，如MET扩增、HER2扩增、IGF活化、IL-6活化、VEGF高表达、核转录因子kappa B(nuclear factor-κB，NF-κB)信号途径的激活等。组织学转化主要指非小细胞肺癌向上皮间质转化(EMT)或小细胞肺癌(SCLC)转化。该途径是NSCLC上皮细胞在细胞外因子刺激后通过特定程序转化为丧失极性、迁徙能力强的间质细胞表型或小细胞肺癌表型的过程，此种转化不易经常规治疗后恢复。下游靶点激活如KRAS、BRAF和PIK3CA突变，以及抑癌基因PTEN和NF-1的缺失等。下游靶点的激活情况可以作为细胞对EGFR-TKIs敏感性的独立预测因素。

2 中医药逆转EGFR-TKIs获得性耐药的实验研究

2.1 中药提取物

康小红等[17]采用具有抗肿瘤作用的蟾毒灵和吉非替尼分别作用于肺腺癌耐药H1975细胞裸鼠皮下移植瘤，两药联合干预下的瘤组织中p-EGFR、p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平较吉非替尼组、蟾毒灵组均有明显下调(P<0.01)，因此推断蟾毒灵阻断了EGFR-PI3K/Akt信号通路而发挥逆转吉非替尼耐药的作用。

欧阳学农等[18]发现吉非替尼联用具有抑癌、抑菌作用的蒽醌衍生物大黄素可显著降低吉非替尼耐药细胞株HCC827/GR中p-EGFR、p-ERK1/2、p-MET的表达，认为大黄素逆转EGFR-TKIs耐药可能和抑制c-Met活化有关。

盛琦等[19]通过体外实验研究发现将中药有效成分姜黄素作用于肺癌PC9/G2细胞株可逆转其对EGFR-TKIs耐药，采用RT-PCR法检测发现姜黄素可上调Caspase-3凋亡蛋白的表达并干预PI3K-Akt通路，这也可能是姜黄素逆转PC9/G2细胞株耐药的作用机制。张卫平等[20]进一步研究了姜黄素对非小细胞肺癌NCI-H1975细胞细胞耐药性的逆转作用，发现姜黄素联合吉非替尼组的p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK的蛋白表达显著降低，尤其是经姜黄素溶液预处理后的联合用药组，分析姜黄素的逆转耐药作用与其下调p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK的蛋白表达水平作用有关。

王媛等[21]通过实验发现紫草素联合埃克替尼可明显抑制肺腺癌耐药H1975细胞凋亡，Western Blot结果显示联用组的p-ERK、PARP蛋白表达受抑制，推测紫草素逆转EGFR-TKI耐药可能是因为联用组阻断了EGFR下游MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路分子活化。

张爱琴等[22]检测到β-榄香烯联合吉非替尼组的人肺腺癌耐药细胞PC9/ZD中P-糖蛋白(P-gP)及survivin的表达水平明显降低，分析β-榄香烯可逆转吉非替尼耐药是因为其明显降低了耐药细胞内耐药相关蛋白P-gP及survivin的表达水平。陈琦等[23]研究了榄香烯逆转由HGF诱导的肺癌PC-9细胞对吉非替尼耐药的机制，发现抑制HGF活化和影响c-MET下游信号通路可能是该机制的关键。

朱银松[24]发现白藜芦醇联合吉非替尼干预的非小细胞肺癌耐药细胞株PC9/G细胞中p53、p21、Caspase-3蛋白表达水平升高，白藜芦醇通过诱导细胞自噬、衰老，阻滞细胞周期，逆转PC9/G细胞对吉非替尼的耐药性。

戴彭辰[25]通过实验研究发现，中药黄芪的有效成分黄芪甲苷通过促进SIRT6蛋白过表达而抑制NF-κB活化，从而恢复肿瘤细胞对靶向药物的药物敏感性。

蔡雪婷等[26]分别对双氢青蒿素联合吉非替尼对敏感细胞株PC-9、耐药细胞株H1975的细胞存活增殖力和EGFR/STAT3信号通路变化情况做了研究，发现联合用药指数值表现优于单药，且双氢青蒿素在不影响TKI活性的前提下抑制吉非替尼诱导的STAT3反馈激活途径而抵抗耐药。

丘韶校等[27]将不同浓度的葫芦素B作用于吉非替尼耐药细胞株PC-9/GR细胞，检测细胞的增殖抑制、周期抑制及凋亡诱导效应，发现葫芦素B对细胞增殖抑制、周期阻滞及对p-Jak2、p-STAT3蛋白表达抑制呈浓度依赖，但p-EGFR的激活以及总EGFR、Jak2、STAT3的表达不受影响，由此可见葫芦素B通过特异性抑制STST3途径逆转细胞对吉非替尼的耐药性。

Lou W等[28]通过体外实验发现重楼皂苷I有效地恢复了厄洛替尼获得性耐药肺腺癌细胞株HCC827的药物敏感性，且逆转了肿瘤EMT并抑制了IL-6/STAT3信号通路的激活。

孙伟红等[29]观察瑞香狼毒联合吉非替尼干预后的裸鼠总生存期、移植瘤体积和血清中Bcl-2、p-EGFR含量，发现瑞香狼毒在延缓荷瘤小鼠肿瘤生长速度、延长荷瘤小鼠生存期的同时可显著降低Bcl-2和p-EGFR的表达，提示抑制EGFR磷酸化和降低Bcl-2凋亡蛋白表达可能是其逆转TKI耐药的机制。

沈云飞等[30]发现苦参联合吉非替尼使人肺腺癌耐药细胞PC9/ZD细胞增殖抑制率和细胞凋亡率明显升高，由于波形蛋白(Vimentin)及N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达下调，E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达上调现象明显，考虑苦参通过改善细胞上皮间质转化而提高耐药细胞对吉非替尼的药物敏感性。

张郜晨茜等[31-32]从EGFR/PI3K/Akt通路着手研究南方红豆杉水提物协同吉非替尼对人肺腺癌细胞增殖的抑制作用，发现水提物逆转吉非替尼耐药与T790M突变和c-MET扩增有关，而抑制HGF/Met/PI3K/Akt信号通路是克服阿法替尼耐药的关键。

2.2 中药制剂

消癌平注射液(Xap)是中药通关藤的精提取物是临床上常用于肺癌、消化道肿瘤和白血病等多种恶性肿瘤的中药注射液。韩淑燕等[33]用免疫组化法和Western蛋白印迹法研究Xap对吉非替尼耐药细胞H460和H1975荷瘤裸鼠的疗效及其机制，实验中发现抑制EGFR下游信号通路PI3K/Akt/mTOR和ERK活化可能是Xap逆转吉非替尼耐药的机制。

张帆[34]通过一系列实验方法研究康莱特注射液及吉非替尼处理后的人肺腺癌A549细胞，检测到联合组p-Akt及c-Met在转录水平及蛋白水平均明显下调，提示PI3K/Akt通路的Akt磷酸化下调与c-Met/ErbB3/PI3K通路的c-Met表达降低是康莱特注射液抑制吉非替尼耐药的重要因素。

Pan Z等[35]采用Western blotting法检测参芪扶正注射液(SFI)处理过的PC-9和PC-9/GR细胞中p-MEK、p-ERK和SREBP1的表达，MTT法检测细胞增殖，划痕实验检测细胞迁移，探讨MAPK/SREBP1信号转导通路在吉非替尼耐药中的作用。发现SFI通过抑制MAPK/SREBP1通路调节对吉非替尼的耐药性，SFI联合吉非替尼可增强吉非替尼与EGFR的结合，从而恢复细胞对吉非替尼的敏感性。

孙玺媛等[36]使用金复康口服液作用于人肺腺癌PC-9细胞，研究其对吉非替尼耐药细胞的逆转作用，通过Western-Blot及RT-PCR研究发现金复康口服液与吉非替尼联合组相较于吉非替尼单药组，其P-EGFR蛋白及P-EGFR mRNA的表达均有显著降低，说明其逆转耐药的机制可能与下调P-EGFR的表达有关。

蒋立峰等[37]采用清肺化瘀解毒方(由苇茎、薏苡仁、冬瓜仁、桃仁、夏枯草、蜈蚣、全虫、鱼腥草、鸡内金组成)和吉非替尼联合干预吉非替尼获得性耐药细胞株A549/R，增殖和凋亡实验提示该方有逆转吉非替尼获得性耐药的作用，进一步Western-Blot及RT-PCR实验结果显示联合组A549/R的CMET、IGF-1R蛋白及mRNA表达水平受到明显抑制，提示下调CMET、IGF-1R表达可能是清肺化瘀解毒方逆转吉非替尼获得性耐药的关键。

陈舒怡等[38]采用MTT法、流式细胞术、Western-Blot法探究养阴解毒方联合吉非替尼抑制由于T790M突变产生的TKI耐药机制，实验结果表明联合组细胞增殖被明显抑制，Caspase-3、Cleave Caspase-3、PARP、Cleave PARP等凋亡相关蛋白的表达水平明显升高，因此认为养阴解毒方逆转T790M突变的耐药株H1975细胞对吉非替尼的与上调Caspase-3、Cleave Caspase-3、PARP、Cleave PARP蛋白有关。

罗杨等[39]研究了除痰解毒方对人肺腺癌耐药细胞株H1975裸鼠移植瘤EMT相关蛋白表达的影响，发现除痰解毒方不同程度地上调上皮型标志物E-cadherin蛋白及mRNA的表达，下调EMT核心转录因子Snail和间质型标志物Vimentin蛋白及mRNA的表达，除痰解毒方通过EMT途径逆转吉非替尼耐药机制可能与调控EMT相关蛋白的表达有关。

3 中医药逆转EGFR-TKIs获得性耐药的临床研究

近年来，中医药联合EGFR-TKIs治疗非小细胞肺癌的临床研究不断涌现，通过学习近年来的相关文献，归纳总结相关研究后有如下发现。

康小红等[40]通过临床观察发现益气养精、解毒散结的肺岩宁方使吉非替尼/厄洛替尼治疗的EGFR突变晚期肺腺癌患者有更好的生存获益，联合治疗组的中位无进展生存期(mPFS)较靶向单药组显著延长。益气通络解毒方是具有益气通络扶正、解毒散结功效的安徽省立医院中医肿瘤科自配方，张慧敏等[41]观察统计后得出，益气通络解毒方联合靶向治疗组的PFS为29.5个月，较单纯靶向治疗组的PFS为12.4个月有显著差异。茆俊卿教授以其临床经验自拟的扶正抗癌方具有益气补中、健脾益肺、活血化瘀、化痰散结、清热解毒的功效。柴小姝等[42]通过观察51例EGFR基因突变的中晚期NSCLC患者发现扶正抗癌方可有效延长患者的(OS)和(无进展生存期)PFS。现有实验研究表明，益气养阴扶正、解毒散结之益气养阴解毒方可抑制Lewis肺癌细胞增殖并诱导其凋亡，张敏等[43]发现益气养阴解毒方改善了患者的mPFS(9.00个月：7.70个月，P<0.05)。中药人参提取物人参皂苷Rg3在拮抗血管内皮生长因子(VEGF)抑制血管新生进而抗肿瘤方面证实有效[44]，江冠铭等[45]发现经人参皂苷Rg3联合奥希替尼治疗的实验组患者mPFS为16个月，优于经奥希替尼单药治疗的对照组患者的13个月。

4 结语

关于EGFR-TKIs治疗NSCLC获得性耐药的研究是目前肿瘤靶向治疗的难点和热点。前期相关研究发现，EGFR-TKIs治疗NSCLC产生获得性耐药的机制涉及EGFR二次突变、旁路激活、组织学转化及下游靶点激活等多方面，且不同耐药机制之间相互联系和影响，可见其耐药机制的复杂性和多变性。无论是否依赖EGFR通路介导的获得性耐药，调控癌细胞的生长、增殖、转移及凋亡均需要RAS/RAF/MAPK/ERK、PI3K/Akt/mTOR和STAT3条下游信号转导通路的持续活化，这为探寻逆转EGFR-TKIs获得性耐药的有效药物奠定了良好基础。

尽管新一代EGFR-TKIs不断被研发与应用，创新性耐药防治策略不断涌现，但耐药现象仍未得到解决。中药具有多途径、多靶点、多重药理学效应、不易产生耐药性等特点，能通过调控多个通路实现抗肿瘤生成效应。因此，中药在改善、延缓甚至逆转EGFR-TKIs获得性耐药方面具有长足优势。虽然中药联合EGFR-TKIs治疗NSCLC有效性和优越性突出，但是，该研究现状仍具有一定的困难和局限，如缺乏前瞻性、大样本、多中心临床研究数据，缺乏体内实验证据，许多研究缺乏严谨的科研设计，难以提出有力的循证医学证据，肿瘤内部异质性影响活检标本的代表性，耐药机制尚不明确，逆转耐药机制大多笼统归纳为下游靶点激活而对具体耐药机制的介绍模糊中药水煎剂成分难以稳定、中药临证应用灵活多变，缺乏最优的给药时机、途径和方式的探寻等问题仍有待解决。对于中药逆转EGFR-TKIs治疗NSCLC产生获得性耐药的研究仍处于探索阶段，进一步探究中医药治疗的优势和机制，以及临床的有效性、安全性是今后的重要课题。