组织来源不同的间充质干细胞生物学特性及COPD 治疗的研究进展

周斌林，熊丽娇 综述；曾治平* 审校

（1.江西省赣南医学院，赣州 341000；2.江西省赣南医学院第一附属医院全科医学科，赣州 341000）

慢性阻塞性疾病 (chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是普遍存在、可及时预防、及时治疗的呼吸系统慢性疾病,是以小气道结构和（或）肺泡异常引起持续性气流受限并进行性加重为主要特征[1]。 现慢性阻塞性肺疾病已逐渐成为了重要的公共卫生安全问题,根据GBD（全球疾病负担）研究,从1990 年到2013 年,COPD 从全球疾病负担的第八位上升到第五位[2]，且相关数据统计,仅在2017 年,COPD 在中国和美国地区造成1135.2 万死亡人数,占当年全球COPD 死亡总人数的三分之一[3]。COPD 的发病率及死亡率因持续暴露于COP D 危险因素及全球社会人口结构改变正逐步升高，预计到2020 年将上升为全球致死疾病的第三位[4]。 目前COPD 严重危害人类健康，虽采用现有的各种治疗措施如家庭氧疗、糖皮质激素、支气管扩张剂等治疗措施可有效缓解气道炎症,提高生活质量, 但并不能有效预防疾病进展或修复肺结构/肺功能[5]。 随着对间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC） 研究的不断深入，MSCs 已成为当前治疗慢性阻塞性肺疾病一种潜在新的有效治疗手段。 不同组织来源的MSC 的增值、分化、免疫表型及免疫调节活性等生物学特性在多方面不仅存在差异，而且对患者治疗效果有影响。 现主要将探讨骨髓、脂肪、脐带等不同组织来源的MSCs 生物学特性的差异及治疗COPD 的相关研究进展。

1 间充质干细胞

间充质干细胞是来源于不同的受体组织或不同器官的一种多能干细胞，如脂肪细胞、骨髓、脐带血及羊水， 而且具有分化为不同中胚层细胞谱系的特性[6]。 国际细胞治疗学会和组织干细胞委员会根据三个基本标准化来定义间充质干细胞：⑴在一个标准化的培养基中充分黏附于塑料表面，⑵充分表达CD105、CD73、CD90 细胞表面标志物，缺乏对造血细胞表面标志物CD34、CD45、CD79a、CD14、CD11b、CD19、CD11a 和 HLA-DR Ⅱ类分子的表达，⑶在体外可多向分化为骨细胞、脂肪组织细胞、软骨组织细胞的能力[7,8]。 多项研究成果表明MSCs 不仅具有自我更新及向其它组织分化的能力，还对多种先天性或适应性免疫细胞具有免疫调节作用，如可以抑制树突状细胞（DC）的自我分化及成熟、促进巨噬细胞向M2 型细胞极化、抑制自然杀伤细胞 （NK）、NKT 细胞、B 细胞、CDT 性细胞增殖及诱导 Treg 性 T 细胞扩增等[8-11]。 MSCs 的免疫调节作用主要是通过多种可溶性介质的释放经旁分泌途径参与[12,13]。 此外，Huaman 等[14]研究中发现MSCs 缺乏表面组织相容性复合体I 和II 及T细胞表面共刺激分子（CD40、CD80 及 CD86）的表达导致MSCs 免疫源性较低，可有效逃避免疫排斥反应。这些特性使得MSCs 成为包括慢性阻塞性肺疾病在内的多种疾病理想的治疗细胞类型。

2 组织来源不同的间充质干细胞生物学特性差异

2.1 分离和增殖 骨髓组织是分离多能MSCs 的主要组织来源并被广泛应用于基础及临床研究。骨髓间充质干细胞 (bone marrow-mesenchymal stem cells, BM-MSCs）的分离是一种创伤性相对较高的过程，在Turinetto 等[15]研究中发现骨髓来源的间充质干细胞的数量、寿命、分化及增值潜能与个体年龄呈负相关。 脐带间充质干细胞（Umbilical cord -mesenchymal stem cells, UC-MSCs） 和脂肪间充质干 细 胞 （Adipose-derived -mesenchymal stromal cells, ASCs）可通过创伤较小、规模大、更安全的方法分离，在 Seo 等[16]和 Vanpham 等[17]研究中发现脂肪和脐带组织来源的间充质干细胞可在长时间内维持其生物学特性。 UC-MSCs 和ASCs 有望成为MSCs 的替代组织来源。 组织来源不同的间充质干细胞在体外均可增殖培养， 但体外增值培养仍有差异。 Chen 等[18]在间充质干细胞体外增殖培养研究中发现UC-MSCs 增殖培养能力最强， 但Nakao等[19]研究中发现BM-MSCs 增殖培养能力最高，而ASCs 与 BM-MSCs 和 UC-MSCs 相比，ASCs 增殖能力相对较弱。 间充质干细胞体外增值能力不同可能与不同细胞传代数或起源组织内的增殖力不同有关。

2.2 免疫表型 组织来源不同的间充质干细胞均可表达典型间充质干细胞的免疫表型， 但不同组织来源的间充质干细胞免疫表型具有差异。 骨髓间充质干细胞高度表达 CD49f （整合素 a6）和PODXL，而 ASCs 对 CD34 表达水平较高，且其他组织来源的间充质干细胞表达较低的CD34，并且ASCs 高度表达 CD49d(整合素 a4)、CD54(ICAM-1)[20]。 Chu 等[21]研究中发现免疫表型 CD36+/CD106-对骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞有一定鉴别作用。 此外，不同组织来源的MSCs 的免疫原性表达程度水平不同。Alhattab 等[22]研究表明BMMSCs 的 HLA-DR 和 HLA-DBQ2 类及 HLA-C 类MHC 分子表达最高。 Huaman 等[14]研究中发现 AS Cs 与 BM-MSCs 相比,ASCs MHC-I 和 MHC-II 基因和蛋白表达水平较低，提示ASCs 具有较低的免疫原性。 此外，Ma 等[23]研究中发现 UC-MSCs 同样具有较低的免疫原性。 这意味着骨髓间充质干细胞易引起适应性免疫应答， 不利于同种异体细胞移植及存活。

2.3 细胞因子 现有的研究表明间充质干细胞主要是通过多种可溶性介质的释放经旁分泌作用发挥免疫调节作用。 大量实验数据已表明不同组织来源的间充质干细胞分泌的可溶性介质不同。Ostanin 等[24]在分析不同组织来源的MSC 分泌可溶性介质的研究中发现BM-MSC 自发性产生可溶性介质的水平较低，ASCs 自发性分泌更多的IFN-γ,IL-2,IL-1β,TNF-α,IL-4,IL-6,G-CSF,GM-CSF 和趋化因子,ASCs 表现为显著的促炎、免疫调剂和刺激造血功能, 但在LPS 刺激下BM-MSC 分泌可溶性介质明显增加，ASCs 分泌水平无明显提高。有研究发现骨髓间充质干细胞分泌较高的IL-6、IL-10、TGF-β1、PGE、VEGF[19,25]。Dabrowski 等[26]研究中发现脐带间充质干细胞比ASCs 分泌较高的TGF-β 和较低的 VEGF, 而 IL-6、IL-10、TNF-α、MMP-1、MMP-13 等细胞因子分泌水平两者无明显差异。此外，细胞因子分泌与免疫相关基因表达有关，不同组织来源的MSC 免疫相关基因表达也有差异[10,11,22]。

2.4 免疫调节活性 大量研究表明间充质干细胞在体内或体外均可对多种先天性和适应性细胞发挥免疫调节作用，但不同组织来源的MSCs 对免疫细胞调节能力存在差异。 Ribeiro[27]等研究发现脂肪、骨髓、脐带三种组织来源的MSC 在与PHA 刺激的单核细胞共培养时，三者均可有效抑制CD4、CD8T 细胞活化及对淋巴母细胞特征的获取，其中ASCs 抑制作用更明显，而与BM-MSCs 和ASCs 相比较，UC-MSCs 对B 细胞的活化及CD56NK 细胞的活化激活无明显抑制影响。 Valencia 等[28]对来自同一供体的BM-MSCs 和ASCs 在与NK 细胞共培养研究中发现两者对NK 细胞的增殖、细胞因子分泌、 活化受体及细胞毒性的免疫调节作用两者之间无明显差异，但ASCs 抑制树突状细胞分化的能力更强。 此外，另一项研究表明BM-MSCs 和UCMSCs 可促进巨噬细胞向抗炎表型（M2 型）极化，而ASCs 对促进巨噬细胞极化无明显调节作用[29]。Deng 等[30]研究中发现脐带间充质干细胞还可通过分泌IL-6、HGF 诱导单核细胞向低表达共刺激分子CD14+CD1a-细胞分化，且该诱导单核细胞显著表达IL-10。 间充质干细胞的免疫调节活性还与细胞传代数有关。 ElSayed 等[11]研究中发现骨髓间充质干细胞与巨噬细胞共培养中，BM-MSCs 早期传代细胞促进巨噬细胞M2(抗炎)表型转化，而晚期传代细胞则促进向M1（促炎）表型转化，且晚期传代细胞对CD4、CD8T 细胞增殖抑制作用减弱。Zhuang 等[31]研究中发现衰老的UC-MSCs 比骨髓间充质干细胞表现出更强的免疫抑制活性， 这可能与衰老的 UC-MSCs 中 HMOX-1、IL-10、IL-6 和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）等免疫抑制基因上调有关。

3 MSCs在COPD治疗中的研究进展

大量基础研究及临床前研究表明间充质干细胞具有免疫调节、 促血管生成及促组织再生修复等生物学特性，并在移植物抗宿主病[32]、系统性红斑狼疮[33]、视网膜病[34]等疾病研究中取得令人鼓舞的结果。 间充质干细胞治疗COPD 在临床前肺气肿小鼠模型研究中被证实有效。 WenGu 等[35]在骨髓间充质干细胞治疗香烟诱导的肺气肿小鼠模型中发现与对照组相比，BM-MSCs 处理的肺气肿小鼠肺组织病理显示炎症浸润及肺泡结构破坏明显改善。 Kennelly 等[36]研究中发现 BM-MSCs 在弹性蛋白酶诱导的慢阻肺小鼠模型中同样显示MSC 治疗后可减少肺泡损伤及肺内胶原基质堆积。 此外，Fukui 等[37]在弹性蛋白酶诱导的肺气肿小鼠模型中证实ASCs 可分化为肺泡上皮细胞修复肺损伤及改善肺功能。

间充质干细胞进行了多项治疗COPD 的临床实验。 Weiss 等[38]研究中纳入了62 例中至重度的COPD 患者并接受了4 次MSC 输注， 并在第一次输注后随访2 年，结果显示MSC 组27 名患者和安慰剂组28 名患者出现不良事件， 其中MSC 组10例，安慰剂组8 例发生严重不良事件，但大多数不良事件报告为轻度，在 FEV、FEV 预测值、FVC、肺活量等方面两组无显著统计学差异， 但MSC 组循环CRP 早期较基线水平下降。 Oliveira 等[39]研究中招募了10 例重度肺气肿患者并分为EBV（单向支气管瓣植入术）+MSC（实验组）和EBV+生理盐水（对照组），进行90 天的随访，在MSC 注射期间未观察到严重或显著的临床症状及体征， 其中实验组和对照组分别发生2 例和3 例不良事件， 两组患者的肺功能 （如：FEV、FVC、FEV/FVC、TLC）、体重指数和6min 步行实验结果显示无明显差异，但EVB+MSC 组循环 CRP 在第 30、90 天较基线水平显著下降。 Stolk 等[40]研究中招募了10 名重度肺气肿患者并进行2 次肺减容手术， 在第一次肺减容手术时分离BM-MSCs 并进行体外扩增，在第二次手术前3 周和4 周分别进行静脉输注BM-MSCs，并在最后一次BM-MSCs 输注后3 周内进行评估，结果表示在输注48 小时内及3 周内均未出现症状或毒性反应， 且该研究还采用免疫组化及PCR技术分析了两次手术后的肺组织， 结果显示经BM-MSCs 输注后， 肺泡间隔的内皮标志物CD31的表达增加了 3 倍， 证明MSCs 可诱导 CD31 表达，而CD31 在内皮细胞迁移及血管生成中扮演重要角色，此外，随访1 年后，FEV 较基线增加了(390±240)ml，残气量减少了(540±145)ml，所有患者的体重平均增加了4.6kg， 其可能是肺减容术及间充质干细胞治疗综合作用的结果，然而，临床上应用间充质干细胞治疗COPD 是否可改善肺功能尚不明确，仍需进一步研究。 综上所述，在COPD 患者进行多剂量间充质干细胞治疗似乎是安全的、 可行的，并可减少炎症反应，这些研究结果为临床上应用间充质干细胞治疗COPD 提供重要依据。

4 结论

现在大量研究表明间充质干细胞治疗COPD是安全、可行的，但同时需要考虑不同组织来源的间充质干细胞在分离和增殖、 免疫表型、 细胞因子、免疫调节功能等生物学特性方面存在差异。 骨髓组织现为间充质干细胞提取的主要组织来源，但骨髓间充质干细胞提取创伤大，提取细胞数量、增殖能力受年龄影响， 其免疫调节能力与细胞传代数有关。 脂肪和脐带来源的间充质干细胞来源丰富，容易获取，免疫原性相对较低，利于细胞移植及存活等优点，使其成为理想的替代组织来源，但是否适应体内的环境仍需要进一步研究。 因此我们可以根据不同来源的间充质干细胞的生物学特性差异，选择性的服务于临床，为今后临床治疗COPD 选取合适理想的种子细胞。