质谱快速鉴定两例AIDS合并真菌性血流感染病例分析

丁 宁，王玉月

(1.常州市妇幼保健院检验科，江苏常州 213000；2.常州市第一人民医院检验科，江苏常州 213003)

获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的严重危害人类健康的传染病，以损伤免疫系统为主要特征，患者极易获得机会性感染，而新型隐球菌、马尔尼菲蓝状菌等深部真菌的机会性感染是AIDS患者死亡的主要原因之一[1]。新型隐球菌最常引起的感染为隐球菌性脑膜炎，其发病隐匿、病死率高。患者主要表现为难以忍受的头痛，伴发热、恶心、呕吐，脑膜刺激征阳性等脑膜炎的症状与体征[2]。隐球菌性脑膜炎在健康人群中很少发生，但在AIDS患者中发病率较高。马尔尼菲蓝状菌是一种条件性高致病性真菌，同时也是青霉菌属中唯一的双向真菌，主要侵袭免疫低下的人群，尤其是AIDS患者。其临床表现复杂多样且缺乏特异性，有文献报道，85%的马尔尼菲蓝状菌感染发生于AIDS患者，已成为AIDS临床诊断的指征性症状之一[3]。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种新型软电离生物质谱技术，通过检测每种病原菌特征性的蛋白指纹图谱，并与数据库中的图谱库进行比对即可鉴定出待测病原菌。将MALDI-TOF MS联合分离胶促凝管直接检测血培养阳性瓶中的病原菌，可以极大地缩短检测时间[4]，为临床提供可靠的诊断依据。

本文通过回顾分析2例明确诊断的合并真菌感染的AIDS病例，探讨质谱鉴定对AIDS患者合并真菌感染诊断的临床价值。

1 病例资料

1.1一般资料 2018年9月常州市第一人民医院呼吸科及血液科收治的2例合并真菌感染的HIV患者。病例1，男，56岁，因“咳嗽伴乏力、纳差半月余”入院。患者入院前1月无诱因出现阵发性咳嗽，1周前至当地医院就诊查胸片提示支气管炎，予“顺尔宁、苏黄止咳胶囊”，症状无改善，后出现乏力、纳差进行性加重。2 d前进食后呕吐少许胃内容物，于本院门诊就诊并行相关检查。患者自述自起病来进食逐步减少，体质量减轻约5 kg。患者神志清，精神萎，慢性病面容。胸部CT示右肺下叶多发空腔性病变，多发肺大疱伴感染，右肺下叶外基底段结节，右肺上叶后段少许炎症，左肺多发纤维灶。病程中患者出现一次发作性双眼上翻，持续数秒后好转；嗜睡，呼之睁眼，颈部稍有抵抗。诊断为：肺部阴影：真菌感染可能；脑炎(真菌性可能)。病例2，女，39岁，因“发现锁骨上淋巴结肿大2周余”入院。患者2周前无明显诱因发现左侧锁骨上淋巴结酸痛肿大，伴有咳嗽、咳痰、发热，并感全身乏力、头晕不适。患者病程中有晕厥1次，约15 s后意识恢复。患者体温39 ℃，神志清，精神萎。正电子发射计算机断层显像示多发淋巴结氟代脱氧葡萄糖代谢增高，考虑淋巴瘤浸润；左上肺磨玻璃影结节氟代脱氧葡萄糖代谢增高；两肺局部轻度炎症，右中肺微小结节。诊断为：淋巴结肿大待查、肺部感染。

1.2MALDI-TOF MS鉴定 抽取5 mL阳性血培养液注入分离胶促凝管，需氧瓶抽取的血培养液以4 000 r/min离心10 min，厌氧瓶中抽取的培养液经3 500 r/min离心7 min，分离待测病原菌。弃去分离胶促凝管内上层液体，缓慢注入1 mL无菌蒸馏水将待测菌沉淀混悬(不破坏促凝胶)，将混悬液转移至无菌1.5 mL小型离心管中，经13 000 r/min离心1 min。弃去上清液后重复洗涤一次，最后将离心后管底的细菌混悬于1 mL无菌蒸馏水中待检。取300 μL待测菌重悬液与900 μL无水乙醇混合，经13 000 r/min离心1 min后弃去上清液，再经多次离心以完全去除残留的无水乙醇，放置于空气中自然干燥。加入70%甲酸30 μL使待测菌充分混匀，再加入乙腈30 μL旋涡混匀，经13 000 r/min离心2 min，取上清液用于MALDI-TOF MS鉴定。取制备好的上清液1 μL涂布于96孔金属靶板，室温干燥后在金属靶板表面加入基质液α-氰-4-羟基肉桂酸1 μL，再次室温干燥后进行检测。参数设置：线性，正离子，蛋白峰谱m/z范围2～20 ×103，激光解析每孔100次。应用Biotyper 3.0统进行数据库比对，得出鉴定结果。

1.3API 20 C板条鉴定 抽取血培养瓶中的培养液进行纯培养，将分离到的菌落用无菌生理盐水配制成2个麦氏单位待测菌悬液，取100 μL悬液至API C Medium培养基中，混匀后加入鉴定板条，28 ℃培养72 h后进行结果判读。

1.4真菌小培养 将马铃薯葡萄糖琼脂培养基切割成小块置于载玻片上，用接种环挑取纯培养的丝状真菌接种于培养基的四角，盖上盖玻片，28 ℃培养2～3 d后用乳酸棉兰酚染色，于高倍镜下观察真菌形态。

2 结 果

2.1质谱鉴定结果 2例患者均在入院后送检血培养，在血培养报阳后直接用质谱仪进行检测。病例1鉴定结果为新型隐球菌，质谱评分为2.142。病例2鉴定结果为青霉菌属某些种，质谱评分为1.474。见图1。

2.2传统鉴定结果 病例1：患者血培养双侧需氧瓶分别于67、70 h报警阳性，涂片革兰染色镜检找到正圆形的芽生孢子。将标本接种在血琼脂平板、巧克力琼脂平板及沙保弱培养基上，35 ℃ 48 h培养均长出白色光滑酵母样菌落。经API 20 C板条鉴定为新型隐球菌。见图2。病例2：患者血培养双侧需氧瓶分别于77、89 h 报警阳性，涂片革兰染色找到丰富的菌丝及少量真菌孢子，孢子两头钝圆、中间有隔的腊肠形。将标本接种在血琼脂平板、巧克力琼脂平板及沙保弱培养基上，分别于28 ℃和35 ℃孵育48 h，血平板上可见灰白色腊样、膜状平坦菌落，菌落中央可见脐状凹陷； 35 ℃培养的沙保弱斜面上可见白色酵母样菌落，不产生红色色素。28 ℃培养的沙保弱斜面上可见淡红色绒毛状菌落，整个培养基被染成玫瑰红色。真菌小培养后可见分枝分隔菌丝，分生孢子梗光滑，呈帚状枝分散，多为对称双轮生；梗基上有3～6个瓶梗，顶端变窄。通过培养的双相性以及帚状枝形态可鉴定为马尔尼菲蓝状菌。见图2、3。

注：A表示新型隐球菌质谱图；B表示青霉菌某属质谱图。

图1质谱鉴定两例血培养阳性结果

图2 隐球菌血培养直接涂片(10×100)

2.3最终诊断结果 病例1患者经神经内科会诊后考虑脑血管意外及HIV脑病，经市传染病医院会诊后考虑AIDS，中枢神经系统感染，隐球菌脑炎。予甘露醇脱水，伏立康唑静滴抗真菌及纠正电解质紊乱等治疗，并转至市传染病医院进行进一步治疗，目前患者情况稳定，恢复良好。病例2患者淋巴结活检示锁骨上淋巴组织增生，中性粒细胞灶性浸润，小脓肿形成伴多量组织细胞反应，倾向感染性变化。请市传染病医院会诊考虑AIDS，并转至市传染病医院进行进一步治疗。

注：A表示血培养直接涂片革兰染色镜检结果(10×100)；B表示35 ℃孵育48 h菌落形态；C表示28 ℃孵育48 h菌落形态；D表示真菌小培养乳酸棉兰酚染色镜检结果(10×40)。

图3病例2血培养阳性涂片结果及纯培养菌落特点与镜下结果

3 讨 论

真菌性血流感染是AIDS患者较为常见的机会性感染，谢朝云等[5]报道艾滋病合并真菌感染发病率为36.61%。新型隐球菌和马尔尼菲蓝状菌是AIDS常见的机会致病真菌，有文献报道AIDS患者合并隐球菌脑膜炎的一年归因死亡率为24.2%[6]，合并感染马尔尼菲蓝状菌的病死率可达18%～26%[7]，因此及时的病原学诊断是关键。隐球菌性脑膜炎患者多表现为发热、头痛及呕吐等中枢神经症状，病例1中的患者在病程中出现嗜睡、颈部稍有抵抗等隐球菌性脑膜炎相关症状，与最终鉴定结果完全相符合。马尔尼菲蓝状菌感染后，临床表现为发热、肝脾肿大、淋巴结肿大、呼吸和消化系统异常等症状，病例2中的患者经淋巴结活检提示淋巴结脓肿，排除了淋巴瘤的可能，其症状与马尔尼菲蓝状菌感染相符。

回顾2例患者的诊断过程，病例1中的患者怀疑感染，病例2中的患者病情较为复杂，高热且主诉淋巴结肿大，对于这两类临床上暂时无法确诊的患者，首先应采集血液、脑脊液、骨髓等标本进行涂片与培养，尽可能地查找病原学依据[8]，及时的病原学诊断对成功治疗深部真菌感染起到极大的作用[8]。传统真菌鉴定的方法虽然较为准确，但其耗时长，对检验者经验要求高，极易造成误诊及漏诊。质谱仪的使用极大地缩短了检测时间，将分离胶促凝管联合质谱仪可以直接检测血培养阳性的病原菌，缩短了转种培养鉴定的时间。隐球菌的传统鉴定主要依赖API板条，需要72 h才能判读结果，而墨汁染色虽较为便捷，但由于隐球菌荚膜厚薄不定，结果观察受检验者经验影响较大[9]。传统方法鉴定马尔尼菲蓝状菌需要4～10 d[7]，采用质谱快速鉴定的方法当天即可给出该真菌属的初步鉴定结果，且检测结果与传统真菌培养的结果相符合，极大地减少了花费在真菌鉴定上的时间成本[10-11]。虽然对青霉菌只能鉴定到属的水平，仍需结合经典的真菌培养及形态学观察才能鉴定到种的水平，但这无疑可以为临床诊疗争取到更多的时间。此外，相较于传统真菌鉴定方法，使用质谱仪直接鉴定血培养阳性瓶中的真菌操作更加简单，且易于制定标准化操作流程，从而可以减少人为因素造成的鉴定误差。

综上所述，AIDS患者易合并条件致病性真菌的感染，真菌感染的诊断依赖病原学鉴定。传统形态学鉴定对于真菌感染的诊断有重要意义，但其耗时较长，而质谱技术的出现简化了操作流程，缩短了鉴定时间，为临床真菌感染的治疗赢得了时间。提高对不明原因发热或感染患者的血培养送检率，尽早查找病原菌并及时对症治疗，结合新兴的质谱技术缩短病原菌检测时间，为临床诊断提供更加及时可靠的依据。