DNA甲基转移酶2在乳腺癌患者中的表达及意义*

潘小平，洪晓绿，孟 萍，裴德翠，程延东，姚明媚，王 蓉

(花都区人民医院：1.检验科；2.感染科；3.中心实验室；4.输血科；5.乳腺外科，广东广州 510800)

在课题组以前的研究中证实：内皮素-3基因在乳腺癌患者中表达显著减少[1]，原因是该基因DNA启动子发生了甲基化[2]，而DNA甲基化过程是由DNA甲基转移酶(DNMT)催化完成。目前研究发现的DNMT家族(DNMTs)成员至少包括DNMT l、DNMT 2、DNMT 3A、DNMT 3B和DNMT 3L，本文就DNMT 2在乳腺癌患者中的表达及意义进行研究，报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年4-11月在本院接受手术的乳腺癌患者60例作为实验组，年龄36～85岁，平均(54.3±12.0)岁，其中>50岁患者36例，≤50岁患者24例，另选同期体检健康女性50例作为对照组，年龄23～74岁，平均(43.8±14.0)岁，两组年龄间差异无统计学意义(t=1.542，P=0.726)。病理TNM分期按照世界卫生组织2005乳腺癌分类标准[3]，肿瘤大小：T1 15例，T2 17例，T3 17例，T4 11例；淋巴结转移：N0 19例，N1 18例，N2 15例，N3 8例；远处转移：无远处转移(M0)47例，远处转移(M1)13例。其他临床病理特征，ER受体：阴性28例，阳性32例；PR受体：阴性28例，阳性32例；组织学等级：G1 10例，G2 25例，G3 25例。采集标本前均经患者知情同意并签署知情同意书，所有测试者清晨空腹采集外周血2 mL贮存于乙二胺四乙酸二钠抗凝管中，临床资料完善且术前均未经任何治疗。

1.2仪器及试剂 荧光定量PCR仪、Mini型蛋白电泳系统购自美国Bio-Rad公司；Trizol购自美国Invitrogen公司；DNase Ⅰ购自美国Promega公司，实时荧光定量PCR试剂盒、逆转录试剂盒均购自日本Takara公司。

1.3方法

1.3.1外周血单个核细胞提取 取外周血1.5 mL置于离心管中，加入等体积平衡盐溶液，混合均匀。取1.5 mL淋巴细胞分离液置于另一离心管中，将稀释的血液沿管壁缓慢加入离心管中，2 000 r/min离心20 min，吸取上、中层乳白色浑浊液体置于小型离心管中，2 000 r/min离心5 min去血浆，加1 mL 平衡盐溶液，2 000 r/min离心5 min，弃上清，提纯单个核细胞。

1.3.2实时荧光定量PCR 实验组和对照组已分离提纯的单个核细胞，采Trizol试剂盒分别提取其总RNA，使用DNase Ⅰ试剂提纯；紫外分光光度仪测定A260/A280值；琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察总RNA条带；采用逆转录试剂盒获得cDNA，-80 ℃保存备用；DNMT 2上游引物：5′-CCC ACT TGT AGA AGG TCC GTG-3′，下游引物：5′-TTC TCA ACC TGC ACA TCC TCT G-3′，以GAPDH作为对照，上游引物：5′-GAT TCC ACC CAT GGC AAA TT-3′，下游引物：5′-GAT TCC ACC CAT GGC AAA TT-3′，反应条件：95 ℃ 3 min,95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40循环。设定溶解曲线程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，反应结束仪器自动生成溶解曲线图。以倍比稀释的cDNA作为模板，检测循环阈值(Ct)可采用2-△△Ct法计算其相对表达量，其中△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因，△△Ct=△Ct-△Ct对照组最大值，每个样品重复3次，取平均Ct值。

1.3.3蛋白质印迹法(Western blot) 随机选取实验组和对照组外周血标本各4份，1 500 r/min离心15 min，分离血浆，按照蛋白提取试剂盒说明书提取血浆总蛋白，根据BCA蛋白定量试剂盒对总蛋白进行定量分析，取10～100 μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(浓缩胶：60～100 V，30 min，分离胶：100～200 V，60 min)，切下含有目的蛋白的胶条转至聚偏二氟乙烯膜(300 mA，60 min)，室温封闭1～2 h，TBST洗膜后加DNMT 2 IgG抗体(1∶2 000)；内参加入GAPDH抗体(1∶2 000)，4 ℃孵育过夜后，分别加入二抗(1∶4 000)室温孵育2 h，显色1～5 min后洗片，显影。为验证实验过程的完整性以及抗体的有效性，本实验选取兔肌肉组织，捣碎后加入裂解液，充分裂解后，12 000 r/min离心3～5 min，取上清，按照上述相同的步骤，在相同的条件下检测DNMT 2和GAPGH。

2 结 果

2.1RNA纯度及抽提质量检测 提纯的RNAA260/A280的比值均在1.8～2.0，证明提取的RNA无污染，纯度较高。3份随机抽的样本，凝胶成像系统观察总RNA的5 s rRNA,18 s rRNA和28 s rRNA条带清晰可见，证明总RNA抽提比较完整，见图1。

注：1表示17号标本；2表示24号标本；3表示57号标本。

图13份标本总RNA的5srRNA,18srRNA和28srRNA电泳图

2.2DNMT 2 mRNA在两组间的表达比较 实验组DNMT 2 mRNA相对表达量(5.785±3.956)和对照组(4.739±2.359)比较，差异无统计学意义(t=1.642，P=0.103)。

2.3DNMT 2蛋白在两组间的比较 从检测结果看，实验过程完整，无污染，抗体有效，DNMT 2蛋白在实验组和对照组中均无表达，见图2。

注：A表示兔肌肉组织中DNMT 2和GAPDH蛋白的表达；B表示两组随机挑选的标本DNMT 2和GAPDH蛋白的表达；1～4号位置为实验组随机挑选标本，5～8号位置为对照组随机挑选标本。

图2免疫印迹试验验证DNMT2蛋白

3 讨 论

乳腺癌是常见的恶性肿瘤，发病率逐年递增[4]，严重危害女性身心健康。乳腺癌的发生与多种因素有关，某些基因的DNA甲基化改变，可能是乳腺癌易感因素之一，包括NR3C1、PITX2、RB1基因等[5-8]，在本课题组以前的研究中也证实了内皮素-3基因DNA的甲基化与乳腺癌的发生、发展密切相关[2]。

DNA甲基化在细胞增殖、分化、肿瘤基因及抑癌基因表达调控等方面起重要作用，与肿瘤的进展密切相关，如肺癌、肠癌、膀胱癌、乳腺癌等[9-12]。DNA甲基化过程是由DNMT催化S-腺苷蛋氨酸上的甲基转移至胞嘧啶含氮杂环5′位上的修饰反应，是负责将甲基基团添加至CpG二核苷酸的酶[13]，该酶与肿瘤的发生密切相关[14]。

DNMT 2存在于胞质和核内，其结合于核基质处，在有丝分裂前期进入细胞核内，呈现类纺锤体式定位，并在细胞分裂过程中与DNA结合[15]，它在发育中的胚胎内脏、肌肉组织、卵巢囊肿以及增殖中的睾丸细胞等组织中广泛表达[16]。

DNMT 2在乳腺癌中的研究国内外少见报道，而课题组研究了60例乳腺癌患者外周血中DNMT 2 mRNA的表达情况，结果表明，实验组与对照组间差异无统计学意义(t=1.642，P=0.103)，Western blot在两组间均未检测到DNMT 2蛋白的表达，这些结果表明DNMT 2基因和蛋白在乳腺癌患者外周血中的的表达差异无统计学意义，原因可能是DNMT 2仅具有微弱的酶活性，被认为是一种RNA甲基转移酶[17]，其功能主要与转运RNA、非编码RNA以及miRNA等相关[18-20]。因此，它在乳腺癌患者外周血中表达不明显，然而它是否具有DNA甲基化功能，有待更加深入的研究。另外，DNMT 2基因和蛋白在乳腺癌组织中的表达是否有差异，亟待本课题组下一步研究。

4 结 论

DNMT 2在乳腺癌中的研究报道较少，本研究明确了DNMT 2基因和蛋白在乳腺癌患者外周血中表达不明显，因此，DNMT 2基因和蛋白对乳腺癌的诊断、病情监测等临床指导意义不大。