反义寡核苷酸AMO-miR-224在肝癌中的实验研究

王 琪，王 楠，林 琳

(1.大连市妇幼保健院检验科，辽宁大连116033；2.大连医科大学附属第一医院检验科，辽宁大连116011)

microRNA(miRNA)是一类保守进化的内源性非编码小分子RNA，长度约为22个核苷酸，在细胞中可以起到重要的调节作用[1-2]。miRNA最早是在研究线虫突变体遗传时发现的，lin-4可对线虫的发育起到延缓作用[3]。REINHART等[4]随后又在线虫中发现了let-7。而let-7基因及其靶基因的突变均可以使线虫在发育过程中形态改变。

人们目前发现了约3 000个miRNA[5]，与人类相关的miRNA为332个。MURAKAMI等[6]通过对癌旁组织与肝癌组织中miRNA的表达情况进行分析，发现miR-18、pre-miR-18和miR-22在癌组织中存在高表达。国内也基于基因芯片技术对肝癌细胞中miRNA的表达情况进行分析，发现了高表达的miRNA-224[7]。

本实验设计了与肝癌相关miRNA-224的反义寡核苷酸(AMO-miR-224)，通过实验确定AMO-miR-224在肝癌细胞中起到的作用。反义技术基于碱基互补原理，用特定互补的DNA或RNA或其化学修饰产物，阻断蛋白的转录翻译，使得该基因不能正常表达。本研究假设：miRNA-224可能在SMMC-7721的生长凋亡过程起到重要作用，随即将反义寡核苷酸转染进细胞，观察转染后肿瘤细胞生物学活性的改变。

1 材料与方法

1.1材料 细胞株购自中国辽宁师范大学生命科学院；胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；1640培养基购自美国Hyclone公司。

1.2仪器与试剂 针对miRNA-224的反义寡核苷酸，dNTP和RNaseFree H2O购自美国Takara公司；0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸细胞消化液购自美国Gibco公司；LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；Rnase Inhibitor购自美国Promega公司；凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；Hairpin-itTMmiRNAs购自美国Gimma有限公司。

1.3设计反义寡核苷酸序列 根据MiRBase官网提供的miRNA基因序列，设计相应的反义寡核苷酸序列，随后使用BLAST软件进行分析确认，同时找到一条随机合适的对照序列[8]，miRNA-224：5′-CAA GUC ACU AGU GGU UCC GUU-3′(21 bp)；AMO-miR-224：5′-AAC GGA ACC ACT AGT GAC TTG-3′(2 bp)；随机对照序列：5′-ATT AGC GAC GAT GGT GUG GTA-3′(21 bp)。由中国大连宝生物公司对以上的序列进行合成，全硫代修饰，PAGE纯化。

1.4荧光定量PCR(qPCR)检测 培养SMMC-7721与张氏肝细胞，取对数生长期细胞，离心去上清后，使用试剂提取RNA。使用Hairpin-itTMmiRNAs qPCR试剂盒检测miRNA-224的表达情况。

1.5建立AMO-miR-224作用于SMMC-7721的细胞模型 取对数生长期SMMC-7721细胞，在24孔板内以4×104cells/mL的水平接种，每组均做3次重复孔。待细胞贴壁后，去除上清，使用含LipofectamineTM2000-AMO的RPMI-1640培养液，进行转染(6 h)。

1.6SMMC-7721细胞的凋亡情况及AMO-miR-224对SMMC-7721的最佳作用水平与作用时间 流式细胞仪检测AMO-miR-224作用后SMMC-7721细胞的凋亡情况及台盼蓝拒染法筛选AMO-miR-224对SMMC-7721的最佳作用水平与作用时间。实验设计3组：AMO-miR-224组、随机对照组、空白对照组，每组AMO-miR-224的水平为别为0.05、0.10、0.20、0.30、0.60 μmol/L，空白对照组加入与药物同体积的1640培养基。分别培养24、48、72 h后取出一定量的细胞悬液，计数各组的活细胞数(台盼蓝拒染法),重复3次实验，计算出平均值后进行进一步分析。从而确定后续实验所需要的最佳作用水平和时间。后续实验仍设计3组。所选取的AMO-miR-224水平为0.3 μmol/L，培养时间为48 h。流式细胞仪检测细胞凋亡情况，重复3次。

1.7qPCR检测经AMO-miR-224作用后SMMC-7721细胞miRNA-224的水平变化 仍使用终水平为0.3 μmol/L的AMO-miR-224，培养48 h。提取细胞的总RNA。qPCR检测各组miRNA-224的表达情况。

2 结 果

2.1SMMC-7721与张氏肝细胞中miRNA-224的表达情况 目的基因miRNA-224在SMMC-7721细胞中表达量(管家基因U6校正后)为22.42，而在张氏肝细胞表达量(校正后)为2.35，SMMC-7721中目的基因miRNA-224的表达量为张氏肝细胞的9.54倍，即miRNA-224在SMMC-7721细胞表达高于张氏肝细胞。见表1。

表1 目的基因miRNA-224相对表达量

2.2AMO-miR-224对SMMC-7721的最佳作用水平与作用时间 作用水平在0.2 μmol/L时出现对细胞的抑制，当水平为0.6 μmol/L时较多细胞漂浮，形态不完整，表面随AMO-miR-224水平的增加，细胞发生凋亡增加，高水平时死亡数明显增加，呈现明显的量效关系，最终选择的AMO-miR-224的最佳作用水平为0.3 μmol/L。终水平为0.3 μmol/L的AMO-miR-224转染SMMC-7721 48 h后开始抑制细胞生长，细胞凋亡率明显增加，因此,选择48 h为后续实验的作用时间，且随时间增加死亡细胞增多，呈现出显著的时效关系。见图1、2。

注：纵坐标为细胞存活数。

图1不同水平AMO对细胞的生长抑制作用

注：纵坐标为细胞存活数。

图2不同时间AMO对细胞的生长抑制作用

2.3最佳作用水平与最佳作用时间的AMO-miR-224转染SMMC-7721对细胞形态的影响 SMMC-7721细胞为贴壁生长的长梭形，细胞界限清晰。转染后细胞的胞质出现空泡(脂质体形成)，同时细胞出现皱缩，胞质颗粒增多，细胞碎片化等细胞死亡的表现。当水平为0.3 μmol/L时，细胞逐渐死亡，胞质量下降，细胞轮廓不清。见图3。

2.4流式细胞仪检测AMO-miR-224作用后SMMC-7721细胞的凋亡情况 水平为0.3 μmol/L的AMO-miR-224作用于SMMC-7721细胞48 h后，AMO-miR-224组与随机对照组相比，细胞发生凋亡的比率都有明显的升高(包括早期凋亡与晚期凋亡)，说明AMO-miR-224可抑制miRNA-224的表达，促进SMMC-7721细胞的凋亡。见表2。

2.5qPCR检测经AMO-miR-224作用后SMMC-7721细胞miRNA-224的水平变化 经AMO-miR-224作用后，AMO组细胞中miRNA-224表达量(U6校正后)为0.29，而随机对照组细胞(U6校正后)为4.11，随机对照组中miRNA-224的表达量为AMO组的14.17倍。即与随机对照组相比，miRNA-224在AMO组细胞中的表达是下调的，反义寡核苷酸转染细胞后，使细胞miRNA-224表达下调，其后续所产生的对细胞的作用也受到抑制。见表3。

表2 AMO-miR-224(0.3 μmol/L)作用SMMC-7721后细胞凋亡比率

注：AMO-miR-224组与随机对照组比较，*P<0.05。

注：A表示正常SMMC-7721细胞形态；B表示转染后SMMC-7721细胞形态；C表示水平为0.3 μmol/L时细胞形态。

图3细胞形态

表3 3组细胞目的基因miRNA-224的相对表达量情况

3 讨 论

本研究采用反义技术探讨miRNA-224在肝癌细胞中的作用。有研究者针对多种miRNA(如miRNA-194)设计了反义寡核苷酸，结果显示其设计的反义寡核苷酸有抑制小鼠不同组织中相应miRNA的表达的作用，表明可以利用相应miRNA的反义寡核苷酸抑制该miRNA的表达，从而研究使用反义寡核苷酸对miRNA在细胞生长、肿瘤发生等不同情况下起到的作用。

经qPCR实验证实，miRNA-224在SMMC-7721肝癌细胞中有明显的高表达(为张氏肝细胞的9.54倍)。众所周知，SMMC-7721是甲胎蛋白阳性的经典肝癌细胞株,被广泛应用于肝癌相关的研究当中，而张氏肝细胞为人源的正常肝细胞,结果表明，相比于正常肝细胞，miRNA-224在肝癌细胞中高表达，国外文献中也有关于此类结果的相应报道[6-7]。

本研究经台盼蓝拒染法实验从细胞水平上证实AMO-miR-224可以抑制肝癌细胞的生长。而流式细胞术的结果表明，当AMO-miR-224转染后，SMMC-7721细胞与随机对照组(随机序列转染的SMMC-7721细胞)相比，发生凋亡的(包括早期、晚期凋亡)细胞的百分率都明显升高，且差异有统计学意义(P<0.05)。该结果表明miRNA-224有促进肝癌细胞生长的作用。新加坡国立大学生物学研究所WANG等[11]提出，miRNA-224的靶基因是凋亡抑制因子-5(API-5)，miRNA-224可能是通过影响API-5转录后的表达水平从而发挥作用，但具体机制还需要进一步的研究。

当正常细胞癌变时，细胞往往会对生长抑制信号不敏感，从而降低细胞凋亡的水平，获得了无限增殖能力[10-11]。而本实验利用反义寡核苷酸的作用，AMO-miR-224通过与miRNA-224结合，发挥反义技术从而抑制miRNA-224的作用，结果发现肿瘤细胞的增殖受到抑制，细胞凋亡，表明miRNA-224促进肝癌细胞的生长过程，从而推测miRNA-224在肝癌中可能发挥癌基因的作用。

本研究证明针对miRNA-224设计的反义寡核苷酸AMO-miR-224可以抑制SMMC-7721的生长，并且可以使肿瘤细胞发生凋亡，降低SMMC-7721细胞中miRNA-224的表达水平，为肝癌的诊断和治疗提供一个新的靶点、思路[12]。