焦磷酸测序法在幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因检测及药物疗效评价中的应用*

初亚男，张婕妤，陆 瑶，张晏洁，封利颖

(东部战区总医院药理科，江苏南京 210002)

幽门螺杆菌(Hp)是一种革兰阴性杆菌，特异地定植于胃上皮细胞，是人类慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等疾病的主要诱因，中国有40%～60%的人群感染Hp[1-3]。质子泵抑制剂、克拉霉素和阿莫西林组成的标准三联疗法的治愈率正在逐年下降，造成这种现象的原因是Hp对克拉霉素耐药[4]，Hp中23S核糖体RNA基因(23S rRNA基因)A2142G和A2143G 2个单核苷酸多态性(SNP)位点的突变是导致耐药突变的主要原因[5-7]，因此本研究拟采用无需电泳、荧光标记且具有半定量能力的焦磷酸测序方法，通过在Hp特异性的23S rRNA基因的保守区域设计焦磷酸测序引物，得到含耐药位点的23S rRNA的部分片段，对片段中的2个SNP耐药位点进行分析得到耐药信息。实现用药前的耐药评价和感染情况分析，为三联疗法的选择提供依据，同时根据半定量结果实现初步治疗效果的评价。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年5-10月本院内镜中心进行胃镜检查且无胃部手术史，未接受三联或四联治疗的患者为研究对象，共收集了37例患者的镜检组织标本，男19例、女18例。37例患者快速尿素酶试验结果及8例患者的13C尿素呼气试验检测结果由本院消化内科提供。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2仪器与试剂 QIAamp DNA Mini Kit试剂盒和焦磷酸测序试剂盒及退火和结合缓冲液购自德国QIAGEN公司；2×TransTaq®High Fidelity(HiFi) PCR SuperMix Ⅰ试剂盒购自中国北京全式金公司；Takara LA Taq®with GC Buffer购自日本Takara公司；其他试剂均为分析纯；实验用水均为灭菌双蒸水；Q24焦磷酸测序仪购自德国Qiagen公司；A200基因扩增仪购自中国杭州朗基科学仪器有限公司；微量紫外分光光度计购自中国南京伍义科技有限公司。

1.3方法

1.3.1质粒模板和引物合成 根据NCBI中提供Hp 23S rRNA基因序列，将包含有2142GG型，2143AA型，长度为200 bp的基因片段构建重组质粒，由捷瑞生物合成并构建，作为建立焦磷酸测序反应时条件优化的模板。引物由中国上海Invitrogen公司合成，具体引物名称及序列见表1。

表1 检测A2142G和A2143G位点的基因多态性引物

1.3.2黏膜组织获取及组织中基因组DNA的提取 37名患者于胃窦大弯侧取黏膜组织约3 mm×3 mm 2块，一块用于快速尿素酶实验，另一块放置-80 ℃冰箱低温保存。按照QIAamp DNA Mini Kit 试剂盒说明操作可同时共提取组织中人和Hp的基因组DNA，采用紫外分光光度计测定标本的水平和纯度。所有标本A260/A280均在1.8～2.0之间，水平均大于20 ng/μL，可用于后续测序实验。

1.3.3克拉霉素耐药基因检测的PCR扩增体系的建立 采用Qiagen公司的Assay Design Software2.0设计序列，将2条上游引物分别与下游引物组合，扩增梯度稀释得到104、103、102copies/μL的23S rRNA基因质粒，每个梯度重复3次，PCR产物电泳后观察扩增条带(亮度和单一性)确定最优的引物组合。

由于23S rRNA基因的GC水平较高，因此选择了2种专门用于扩增高GC水平的2×TransTaq®High Fidelity PCR SuperMix Ⅰ试剂盒(HiFi体系)和TaKaRa LA Taq®with GC Buffe(GC体系)试剂盒。50 μL HiFi体系包括2×TransTaq HiFi Mix Ⅰ 25 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、模板2.5 μL，加水补充至50 μL。50 μL GC体系包括LA Taq 0.5 μL、2×GC Buffer Ⅰ 25 μL、dNTP 2 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、模板2.5 μL，加水补充至50 μL。选用上述引物组合分别扩增106、105、104、103、102、101copies/μL的质粒模板，PCR产物电泳后观察扩增条带确定最优的扩增体系。

退火温度是影响PCR扩增的关键因素，决定了扩增效率和特异性，因此选择55、58、59.8、63.4、67、70 ℃ 6个退火温度梯度，用灭菌双蒸水作为空白对照，采用HiFi体系进行扩增，PCR产物电泳后观察扩增条带确定最优的退火温度。

1.3.4方法特异性考察 由于从组织中提取到的DNA绝大部分为人基因组DNA，因此需要对引物的特异性进行考察，分别以血液中提取获得的人基因组DNA和13C确诊为Hp感染的人胃窦组织提取的DNA为模板进行扩增，考察本方法的特异性，同时对PCR扩增产物进行Sanger测序，将测序结果与NCBI网站公布的Hp 23S rRNA基因序列进行比对。

1.3.5方法的灵敏度考察 将含有23S rRNA基因的质粒模板梯度稀释成104、103、102、101copies/μL的模板进行本方法的灵敏度考察，每个水平梯度重复3次，将PCR产物进行电泳和焦磷酸测序。进行焦磷酸测序时，第一个“G”出现信号峰代表突变型信号，“A”出现信号峰代表野生型信号。以焦磷酸测序是否获得预期的信号峰来评判本方法的灵敏度。

1.3.6方法与Sanger测序的一致性考察 对20例组织标本的PCR扩增产物分别进行焦磷酸测序和外送至华大基因进行Sanger测序，对A2142G和A2143G位点的检测结果进行分析，评价本方法检测的一致性。

2 结 果

2.1克拉霉素耐药基因检测的PCR扩增体系的条件优化结果 扩增产物的电泳结果表明上游引物2加下游引物的组合扩增条带更明亮，扩增效率更高，因此优选此引物组合，同理，最佳扩增体系为HiFi体系，最佳温度为59.8 ℃。

2.2检测方法的特异性评价 扩增产物的电泳结果表明本方法使用的引物只能特异性地识别含有Hp 23S rRNA 基因组DNA的标本，具备很好的特异性。此外Sanger测序比对的结果表明本方法PCR扩增的产物序列100%同源为Hp 23S rRNA基因序列，因此方法的特异性良好。

2.3灵敏度与基于半定量性能的初步疗效评价 采用焦磷酸测序检测A2142G和A2143G位点的灵敏度为100 copies/μL质粒模板。在考察方法灵敏度时，发现由于焦磷酸测序具备较好的定量效果，不同水平的质粒模板与第一个碱基G的单碱基峰高呈现一定的对应关系，在检测102copies/μL质粒模板时单碱基峰高为约75 mV，103copies/μL质粒模板时单碱基峰高约为125 mV，104copies/μL质粒模板时单碱基峰高约为250 mV。因此，在检测过程中以此为参照，对患者治疗前和治疗后的标本进行检测就可以初步评估患者的治疗效果。见图1。

图1 焦磷酸测序用于评估克拉霉素耐药基因检测的灵敏度

2.4快速尿素酶试验与本研究建立方法的检出率评价 37例患者的胃窦组织标本进行快速尿素酶试验检出18例阳性，Hp 感染检出率为48.7%，焦磷酸测序检出30例阳性，Hp感染检出率为81.1%。快速尿素酶检出的18例阳性标本中除1例外，均与焦测序结果一致。但是由于焦磷酸测序的检测灵敏度高，可检出低至100 copies/μL的模板分子，对于Hp水平较低的标本也可以进行有效的检测，因此对Hp感染的检出率明显高于快速尿素酶实验。此外30例阳性Hp感染的病例中，发现4例克拉霉素耐药，耐药率为10.81%(4/37)。

2.513C尿素呼气试验与本研究建立方法的检出率评价13C尿素呼气试验被誉为是Hp检测的金标准，为了对本方法的检出率进行进一步评价，研究者另外收集了8例患者同时进行13C尿素呼气试验和焦磷酸测序实验。呼气试验的Hp感染检出率为75.0%，本方法的检出率为87.5%，且阳性标本检出的一致率为100.0%。

3 讨 论

幽门螺杆菌感染和胃癌的形成、发展有着密切的关系[8]，中国也积极开展对Hp感染的防控工作[2]，但是Hp的根除率却呈现逐渐下降的趋势[9]，这与Hp的耐药性逐年升高有关[10-11]。克拉霉素是Hp治疗三联疗法中最常用的抗菌药物之一，流行病学数据表明克拉霉素耐药率也呈现出上升趋势[12-13]。如能在治疗前准确测定Hp的耐药类型，有针对性的调整抗菌药物治疗方案，采用个体化三联疗法会达到事半功倍的效果。因此Hp治疗前耐药检测非常重要。传统的分离培养Hp药敏试验方法虽然特异性强，但是会存在培养失败和耗时长的缺点，无法及时为临床指导合理用药提供参考。实时荧光的方法可实现幽门螺杆菌的快速定量检测与分型鉴定，但对序列存在突变的耐药片段进行检测时存在漏检现象[14-15]。

本研究基于焦磷酸测序技术建立的Hp克拉霉素耐药基因的检测方法具备高灵敏、快速、半定量等优点。

4 结 论

本研究建立的方法在测定耐药情况的同时，扩增Hp特有的23S rRNA基因序列，可用于判定Hp感染情况；通过治疗前后测序峰高的数值，可进行Hp感染情况的半定量评价并初步评估治疗效果；为Hp的克拉霉素耐药检测提供了一种新方案。