组织工程在心血管疾病中的应用现状

韩刘君，孙尧，于晓龙

1华北理工大学，河北唐山 063000；2华北理工大学附属医院老年病科，河北唐山 063200

随着老龄化人口的增加，心血管疾病逐渐成为老年人死亡的首要原因[1]。心血管疾病包括心脏疾病和血管疾病[2]。据预测，到2030年，每年约有2330万人死于心血管疾病，尽管心血管疾病在治疗上已取得了重大进展，但仍是全球发病率和死亡率增高的主要原因[3]。因此，制定更好的策略来防治心血管疾病非常重要，应该被医疗从业者重视。

组织工程技术指在传统医疗方法上将细胞种植到具有生物可降解性的支架材料中，从而代替细胞外基质的作用，这种方法已被证实可以将细胞移植到各种动物模型中用来恢复或增强原有组织的功 能[4]。组织工程技术需要3个主要组成部分：细胞资源、基质(支架)及应用线索(生化或生物物理线索)[5]。组织工程学在心血管疾病治疗中多应用于心肌、心脏瓣膜及血管中，本文将从组织工程的不同组成部分及来源分别介绍组织工程技术在心血管疾病中的应用。

1 细胞资源(种子细胞)

理想的种子细胞是组织工程构建成功的关键。目前，细胞主要来源于自体细胞、同种异体细胞及异种细胞，而每种细胞又可以被细分为其他类型的干细胞[6]。干细胞是未完全分化的未成熟细胞，有自我更新和多向分化的特点，作为组织工程中的种子细胞，已被广泛应用于组织和器官的再生研究 中[7]。根据细胞的发育潜力，干细胞可分为胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)及成体干细胞3类[8]。

1.1ESCs ESCs来源于囊胚的内细胞团[9]，是一种多潜能干细胞，可被分化为任何类型的细胞，已成为组织工程种子细胞的可靠来源[10]。Prabhakaran等[11]通过从小鼠的囊胚中分离多能胚胎干细胞，将其种植到纳米支架材料上并定向分化为心肌细胞，结果可观察到诱导分化后的细胞表达心肌细胞表型，由此证明ESCs具有分化为心肌细胞的能力，可作为组织工程心肌的种子细胞。Pucéat等[12]从人类胚胎干细胞(HUESC)中获得了一个Mesp1+细胞群体，利用细胞外基质(ECM)中的某些特定因子，可获得瓣膜心内膜细胞，进而促进早期瓣膜的形成。ESCs虽然在组织工程心肌和组织工程心脏瓣膜研究领域取得了一定成果，但在作为组织工程血管的种子细胞研究尚少，考虑可能有以下两个因素[13]：①ESCs分化不完全，在移植后可能会有肿瘤的发生；②ESCs涉及人类胚胎伦理学问题。因此，在广泛应用于临床治疗心血管疾病之前，必须努力寻找最有前途的细胞类型或其衍生物。

1.2iPSCs iPSCs具有无限的自我更新和分化为特殊类型细胞的能力，已经被应用到许多医疗领域 中[14]。Sugiura等[15]将多能干细胞衍生的心肌细胞(iPS-CMs)接种至可生物降解的心脏贴片上，并植入大鼠心肌梗死模型体内，16周后，观察到iPSCMs可促进宿主心肌细胞的再生及增殖。已有研究表明，细胞疗法可治疗受损的心肌细胞[16]，但在动物模型实验中，有研究者进行了成体干细胞的移植研究，结果发现，移植后的成体干细胞既不能长期存活，也不能在宿主组织中分化为心肌细胞，而iPSCs因具有无限的自我更新能力和明确的心肌生成潜力而成为很有前途的细胞来源[17]。近年来，从iPSCs中获得各种用途的心肌细胞虽然取得了显著进展，但仍面临着一些重大挑战，如现有方法培养的iPSCs来源的心肌细胞表现出高度未解决的转录异质性，缺乏成人细胞样表型所需的成熟细胞[18]。另外，iPSCs也可在组织工程心脏瓣膜领域发挥作用，患者来源的iPSCs可被诱导为瓣膜间质细胞(VICs)，具有维持瓣膜的ECM功能，进而发挥iPSCs在构建组织工程心脏瓣膜中的作用[19]。虽然已有研究指出iPSCs可以作为组织工程心脏瓣膜的种子细胞[20]，但应用到动物实验的研究却极少。

随着组织工程学的发展，组织工程血管已经可以从原代细胞中培养出来，但因原代细胞的可扩充性和供体-受体之间的变异限制了其发展。目前，有研究证实从iPSCs中获得血管组织工程的种子细胞可以解决上述问题[21]，虽然iPSCs的组织工程血管技术已经取得了重大进展，但将组织工程血管应用到临床上仍面临着许多困难，比如，血管移植物与血管组织之间是否会发生炎症反应、移植后结构是否完整及移植后在体内的存活率等，这些都将限制iPSCs作为种子细胞在组织工程技术上的应用。

1.3成体干细胞 是一种非造血多能基质细胞，在特定生长因子的调控下，有向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、心肌细胞及神经细胞分化的潜 能[22]。神经干细胞[23]、造血干细胞[24]、骨髓间充质干细胞(BMSCs)[25]、表皮干细胞[26]等均属于成体干细胞。其中BMSCs已被用于组织工程的心肌[27]、心脏瓣膜[28]及血管[29]研究中。Li等[30]采用含有诱导剂5-氮胞苷的培养基培养BMSCs，15 d后经免疫细胞化学染色方法可检测到细胞表达心肌表面标志物α-肌动蛋白和肌钙蛋白T，采用透射电镜可观察到BMSCs的胞质内有多个肌管样结构。Huang等[31]通过使用成纤维细胞诱导因子14(Fn14)基因转染BMSCs可成功获得瓣膜间质细胞，表明BMSCs可为心脏瓣膜疾病提供一种新的治疗策略。此外，已有研究证明，BMSCs在制备自体组织工程血管移植物及用于急诊血管手术的现成组织工程血管移植物方面具有较好的优势[32]。

综上所述，干细胞因具有多向分化的潜能，在组织工程与再生医学领域受到广泛关注，其中，BMSCs在动物及临床研究中已经取得了一些成果，与ESCs及iPSCs相比，BMSCs具有较少的伦理学问题、较低的免疫原性及较少发生肿瘤风险等优点[33]。因此，在组织工程治疗心血管疾病方面，BMSCs可作为最佳的种子细胞。

2 基质(支架材料)

生物材料已作为3D载体被广泛使用，协助细胞移植到动物或人体内以促进细胞发挥作用，生物材料的引入使移植后细胞的存活率得到了很大的提高[34]。目前，生物材料可被细分为生物活性陶瓷材料、高分子生物材料及复合材料3种类型[35]。生物材料可与生物系统相互作用，在体内具有治疗、增强、替代任何组织或器官的作用，成功的生物支架材料应具有生物相容性，并保持其机械性能，直到被天然组织取代，在替代的过程中解体成小碎片，最终被身体吸收或被排出体外[36]。

2.1生物活性陶瓷 生物活性陶瓷可以是天然的或是合成的，包括珊瑚、生物活性玻璃、硅酸钙、羟基磷灰石(HA)及磷酸三钙(TCP)等生物材料[35]。因其固有的生物相容性[37]，各种生物陶瓷材料在骨组织修复中的应用日益突出，含有磷酸钙的生物玻璃或陶瓷材料被广泛应用于生物医学组织工程中，如骨科植入物、骨缺损修复、金属植入物涂层、牙科及耳廓植入物等医疗领域[38]。尽管生物活性陶瓷具有优异的生物活性，但其主要缺点在于机械强度及断裂韧性较低，因此，在心血管疾病中的应用极少。

2.2高分子生物材料 高分子生物材料包括天然聚合物[如壳聚糖(CTS)、胶原(COL)、纤维蛋白及透明质酸]和合成聚合物[如聚己内酯(PCL)、聚乙酸醇(PGA)及聚乙烯磷酸(PVPA)][39]。高分子生物材料因其独特的性能已经被应用到不同的研究领域，人们开始通过优化其生物化学性能及机械性能，以新型的材料制造技术开发各种材料体系的新产品，进而使天然高分子材料在许多医疗领域内得到高效的应用[40]。Hussain等[41]利用静电纺丝技术制备具有生物活性的三维壳聚糖纳米纤维支架，并将大鼠心肌细胞种植到该支架材料上，结果表明，壳聚糖纳米纤维支架材料在长期的培养条件下仍可保持其柱状形态，同时表现出良好的细胞黏附及铺展特性，而共培养的细胞形成了极化的心肌细胞形态，并保留了长期培养的形态及功能，提示壳聚糖纳米纤维支架材料可以作为一种潜在的支架材料被应用到组织工程心肌的研究中。Puperi等[42]采用透明质酸水凝胶作为支架材料，将瓣膜细胞以3D形式包裹在支架材料中，结果发现，透明质酸水凝胶在3D环境培养条件下保持了瓣膜细胞的表型，并被调整到接近瓣膜海绵层的机械性能，由此证明，透明质酸可作为层状组织工程心脏瓣膜支架海绵层的合适材料。此外，快速内皮化及预防再狭窄是制备小直径血管移植物面临的两大挑战，而植入后的感染往往被忽视，因此，选择合适的生物支架材料对组织工程血管尤其重要。Wang等[43]采用壳聚糖生物支架材料制备不对称的小直径血管移植物，结果表明壳聚糖的加入可使移植物的外层具有一定的抗菌效果，移植物的内层可极大地促进细胞的生长，由此证明壳聚糖的特殊优势将有助于组织工程血管移植物的临床应用。

因此可得出，合成的高分子天然生物材料大多数与其他天然聚合物或生物活性陶瓷材料一起作为复合材料被应用到组织工程技术中，以促使高分子生物材料达到最大的应用价值。

2.3复合材料 复合材料是含有两种或两种以上不同性能的材料以共聚物、聚合物-聚合物混合物或聚合物-陶瓷复合材料的形式组合而成，如聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、硅酸钙(CS)与壳聚糖混合物等复合材料[44]。Wang等[45]将CS引入壳聚糖静电纺丝纳米纤维支架材料中，构建复合的心脏贴片支架材料，结果表明复合的心脏贴片支架材料对心肌细胞的生物活性具有协同作用，体内研究进一步证实，种植了心肌细胞的心脏贴片支架材料可以减少心肌梗死的瘢痕面积并促进血管生成，由此证明硅酸钙/壳聚糖复合心脏贴片支架材料有望成为修复心肌梗死的支架材料。Hasan等[46]采用聚己内酯(PCL)和聚L-乳酸(PLLA)材料构建一种三叶式心脏瓣膜结构，将该细胞种植到该支架材料上，观察到细胞可在PCL-PLLA支架材料上生长并增殖，证实了将硬质聚乳酸与更具柔顺性及细胞黏附性的聚乳酸相结合，可以得到一种强度、柔韧性和生物学性能都较良好的支架材料，在组织工程心脏瓣膜疾病的应用中具有巨大的潜力。天然血管具有多层次、细胞特异性的空间结构，模拟这种空间结构是一条很有前途的血管再生途径。Li等[47]采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)及明胶的混合物制备了一种新型的双向双层管状支架，将具有血管再生功能的内皮细胞及平滑肌细胞接种至支架上，可观察到支架对两种细胞的增殖均具有促进作用，证实双向双层支架是天然血管的优良结构及功能类似物，是一种潜在的血管组织工程候选材料。

最近，生物材料已经作为3D载体被广泛使用[48]。 已有研究表明，将聚乙二醇(PEG)、丙烯酸酯及均质化心包基质(HPM)相结合，开发出了一种可三维打印并可降解的支架，具有重建先天性心脏缺损的潜力[49]。另外也有研究表明，采用海藻酸钠包裹人脐静脉平滑肌细胞通过同轴喷嘴沉积系统以血管导管的形式进行三维打印，可构建组织工程血管[50]。生物支架材料的开发具有一定的挑战性，主要是因为生物材料的表面非常重要，它需要具有良好的黏附性以增强细胞的附着及生长能力。在心脏组织工程的医学研究领域，合成聚合物已经被证明具有良好的生物降解性及力学性能，但其细胞附着能力很差，因此，研究人员重点关注了生物材料的生物功能化以增强细胞的黏附力，并加大细胞与材料之间的相互作用[51]。

3 应用线索(生化或生物物理线索)

生物材料的生化或生物物理线索可以引发细胞发生一系列生理反应，进而刺激受损组织的愈合，生物物理线索可以直接将离子、纳米材料或蛋白质内化到胞质中，而生化线索通过引导细胞内基因组的变化决定细胞的最终转向[52]。简单地说，在体外将细胞种植于生物支架材料上，细胞能够在生物支架材料上生长及增殖，将生物支架材料移植入体内后，细胞可以在体内发生作用。Blondiaux等[53]将BMSCs种植到组织工程纤维蛋白贴片上，并将纤维蛋白贴片移植到裸鼠心肌梗死模型体内，可观察到移植后裸鼠的心脏射血分数较前有所改善，梗死面积及梗死区域周围的纤维化程度均有所减少，结果表明，BMSCs构建的组织工程纤维蛋白贴片能有效改善梗死后心脏的心功能。Jana等[54]将猪瓣膜间质细胞种植到聚己内酯微纤维支架内，并将微纤维支架植入到大鼠模型皮下2个月，结果表明，聚己内酯支架材料可促进细胞在支架上的黏附及增殖，进而证明了瓣膜间质细胞构建的组织工程心脏瓣膜可以改善心脏瓣膜的功能。Jang等[55]采用聚己内酯、海藻酸钠及具有向内皮细胞分化能力的自体间充质干细胞经过3D打印技术制备人工血管，并移植入犬类动物模型中，结果表明，移植后的人工血管可以抵抗炎症，不会发生因移植导致的急性血栓形成。

组织工程技术在心肌、心脏瓣膜及血管在体内的研究虽已经取得了一定成果，但组织工程技术取得成功的关键在于移植的有效率，就现有研究而言，移植的细胞密度、移植到体内存活的概率及移植物在体内的反应机制等问题仍阻碍了组织工程技术在心血管疾病中的发展。

4 问题与展望

种子细胞的选择、支架材料的选取及体内移植的成功与否均为组织工程技术进一步应用到心血管疾病中面临的挑战。尽管组织工程技术在动物研究领域已经取得了一些成果，但真正应用到临床仍面临着很大的困难，主要是：①如何在体外获得足够数量的种子细胞，并判断种子细胞的最佳移植数量及比例；②组织工程组织构建物的大小问题；③体外构建的组织工程组织在移植后细胞的存活率问题。作为一项革命性的全新技术，组织工程技术在心血管疾病中的研究和临床试验不会一帆风顺，但从国内外研究已取得的成果中可得出，使用组织工程技术治疗心血管疾病的前景可期。随着组织工程技术的发展，人类医学的发展也将进入全新的阶段，过去无计可施的疾病有望得到治疗的机会，过去亟需提高疗效的疾病在临床上的治疗局面终将开启一个新的篇章。