非酒精性脂肪性肝病饮食相关动物模型研究进展

薛丽君，肖琨珉，彭红叶，周元琛，李鸿，姚树坤*

1北京航空航天大学生物与医学工程学院，北京 100191；2中日友好医院消化内科，北京 100029；3中日友好医院临床研究所，北京 100029

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的、以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性为主要特征的临床病理综合征，主要包括单纯性脂肪性肝病及其演变的脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、脂肪性肝纤维化和肝硬化。NAFLD与代谢综合征之间关系密切，其中饮食模式是最基本最重要的因素。目前，NAFLD的发病机制尚未明确。基于NAFLD临床特征的复杂性，为了更好地阐明其发病机制，寻找潜在的治疗靶点，评估单独或联合用药的治疗潜力，亟须开发有效、安全的临床前体外和体内模型。现就NAFLD饮食相关动物模型的研究进展及建立新型NAFLD饮食相关模型的重要性综述如下。

1 NAFLD概述

NAFLD是目前全球最常见的慢性肝病之一，其患病率和病死率呈逐年上升趋势。国外流行病学调查显示，成人NAFLD的患病率达20%～30%，2型糖尿病患者NAFLD患病率则高达42%～70%[1-3]，预估全球约2000万NAFLD患者最终死于NAFLD相关的肝病[4]。NAFLD的临床特征复杂，环境与宿主易感基因之间的相互作用决定了其疾病表型，并影响其进展。目前，NAFLD的发病机制由“二次打击”理论发展为“多重打击”理论，即在具有遗传倾向的个体中，炎症的发生往往先于脂肪变性，且多种因素共同诱导NAFLD，包括胰岛素抵抗、脂肪组织分泌的激素、营养因子、肠道微生物群释放的内毒素(脂多糖)、氧化应激损伤，以及遗传和表观遗传因子等，这些因素通过Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)作用于肝实质细胞，促进NASH的进展。研究者普遍认为，肠道微生物群、氧化应激和线粒体损伤在NASH的发病机制中起关键作用，肝-肠轴在肥胖及NAFLD的发病机制中起重要作用。肠道微生物群与宿主免疫系统相互作用，调节肠道通透性，促进炎症发生和胰岛素抵抗[5]。肠道通透性增加致使细菌和内毒素移位，引起促炎分子脂多糖和具有肝毒性的细胞因子产生，这可能与胰岛素抵抗和NASH的进展有关[6]。脂多糖可与TLR4相互作用，诱导全身性慢性低度炎症状态，促进胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和动脉粥样硬化的发生[7]。近年研究显示，代谢性疾病的主要危险因素为肥胖、胰岛素抵抗、久坐的生活方式、不良饮食模式以及遗传因素和肠屏障功能紊乱等[8-9]，其中饮食模式在代谢性疾病的发生发展中起着极其重要的作用。因此，寻找符合人类饮食模式的动物模型对进一步研究NAFLD具有重要意义。

2 NAFLD饮食相关动物模型

NAFLD营养动物模型可分为两类[10]：第一类是指肝脏中脂质输入或合成增加的模型，主要包括高脂饮食或包含胆固醇的高脂饮食模型、高果糖/蔗糖饮食模型，以及二者的复合饮食模型；第二类指减少脂质输出或分解代谢的模型，主要包括蛋氨酸和胆碱缺乏(methionine and choline-deficiency diet，MCD)饮食模型、胆碱缺乏的L-氨基酸定义(choline-deflcient L-aminoacid-defined，CDAA)饮食模型。仅少数NAFLD患者表现出明显的遗传缺陷，表明NAFLD饮食模型与人类疾病的相关性高于遗传模型[11]。人类肝损伤是由复合因素引起的，因此，可采用复合因素制备肝损伤动物模型。目前的肝损伤动物模型多是单因素或双因素造模，即使存在复合因素，也与人类肝损伤不完全相同，易导致实验结果与人类不符，因此，亟须建立多因素复合刺激、符合人类病因和疾病机制的肝损伤动物模型。

2.1 高脂饮食或包含胆固醇的高脂饮食模型Lieber等[12]用液态高脂饮食(71%脂肪、11%碳水化合物、18%蛋白质)喂养雄性SD大鼠，3周后，大鼠肝小叶脂肪变性，表现出胰岛素抵抗、炎性因子表达增加、氧化应激水平升高以及早期纤维化等。另有研究发现，采用强饲法饲喂雄性SD大鼠高脂肪乳剂，6周后，大鼠表现出肥胖、胰岛素抵抗、高脂血症、肝脂肪变性及坏死、炎症和线粒体损伤等[13]。Xu等[14]制备了一个简单实用、精确度较高的NASH大鼠模型，即饲喂大鼠高脂饮食(88%正常饲料、10%猪油、2%胆固醇)，第4周大鼠肝脏重量和肝重指数开始增加，伴肝脂肪变性；第8周大鼠体重和附睾脂肪重量开始增加，伴单纯性脂肪肝；第12周大鼠血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)水平开始升高；第12～48周大鼠发生脂肪性肝炎。高脂饮食12周后，大鼠NASH开始进展，但其脂肪变性和炎症程度较蛋氨酸和胆碱缺乏饮食大鼠轻[15]。

比较饲喂的脂肪类型发现，6～8周后，标准高脂饮食小鼠体重增加较反式脂肪饮食小鼠明显；8～16周后，反式脂肪饮食小鼠肝脂肪变性、ALT水平升高、胰岛素敏感性降低均较标准高脂饮食小鼠明显[16]。高脂饮食模型成功复制了人类NASH的组织病理学特征和代谢综合征表现：组织病理学显示肝脂肪变性，小叶炎性浸润，肝细胞坏死和凋亡，肝细胞气球样变和腺泡3区纤维化；同时观察到NAFLD代谢综合征的其他特征，如中心性肥胖、胰岛素抵抗、血脂异常、氧化应激和脂质过氧化、血清ALT水平升高，以及脂联素和PPAR-α表达降低[17-20]。综上，高脂饮食模型肝脏炎症和纤维化程度较轻，存在持续时间长、强制过量喂养、与人类饮食结构不符等缺点。

2.2 高糖饮食模型 果糖是一种单糖，主要由肝脏代谢[21]，过量摄入果糖与NAFLD的发展及严重程度有关。果糖可加剧肝脏脂肪沉积，促进炎症和氧化应激反应，导致胰岛素抵抗和纤维化[22]。有研究在Wistar大鼠饮食中添加含20%果糖的饮用水，8周后，大鼠出现肝脏单纯脂肪变性，体重增加，血清三酰甘油、葡萄糖水平明显升高，表现出代谢综合征，如中心性肥胖、血脂异常、高血压和高血糖等，但未表现出NASH的病理学特征[23]。

2.3 复合饮食模型 果糖和脂肪结合饮食诱导NAFLD晚期病变的效果较高糖饮食和高脂饮食好。在营养过剩饮食中添加果糖，可促进NASH模型小鼠肝细胞气球样变、炎症及肝纤维化的发生发展[9,24]。另有研究报道，AMLN饮食[40%脂肪(包含18%反式脂肪)、40%碳水化合物(包含20%果糖)、2%胆固醇]可诱导小鼠表现出NASH的典型特征[25-26]。

2.4 蛋氨酸和胆碱缺乏(MCD)饮食模型 蛋氨酸和胆碱这两种必需营养素的缺乏均可导致肝脏β-氧化受损和极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)生成受阻[27]。MCD饮食2周后，小鼠血清谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、ALT水平升高；8～10周，蛋氨酸缺乏导致小鼠肝脏炎症和早期纤维化[28]。MCD饮食10周后，模型动物体重明显减轻(高达40%)。MCD饮食的优点是可在较短的喂养时间内复制NASH的组织学表型，可引起严重的炎症、氧化应激、细胞凋亡和纤维化；缺点是未表现出人类NAFLD的其他代谢特征，如肥胖、外周胰岛素抵抗和血脂异常。综上所述，MCD饮食不能模拟NALFD的所有特征。

2.5 胆碱缺乏的L-氨基酸定义(CDAA)饮食模型CDAA饮食的总体组成与MCD饮食相同，仅蛋白质被相应的L-氨基酸混合物替代。CDAA饮食可抑制肝细胞脂肪酸氧化，促进脂质合成、氧化应激和炎症，导致肝纤维化，其诱导的NASH较MCD饮食重。研究发现，CDAA饮食20～22周，小鼠发生NASH，其体重、血清三酰甘油和总胆固醇水平明显升高，胰岛素抵抗增加[29]。CDAA饮食模型动物体重无明显减轻，无代谢综合征表现。

2.6 其他模型 致动脉粥样硬化饮食含高剂量的胆固醇(1%～1.25%)和胆酸(0.5%)。胆酸可促进脂肪和胆固醇吸收，抑制胆固醇向胆汁酸转化，导致胆固醇含量增加，促进动脉粥样硬化发展[30]。高胆固醇是高脂饮食诱导的NASH模型中肝脏炎症进展的重要危险因素[31-32]。研究发现，饲喂加入10%猪油和2%胆固醇的致动脉粥样硬化饮食可诱导大鼠肝脂肪变性、坏死，肝细胞气球样变，小叶内炎症和纤维化，导致大鼠肥胖、血脂异常、胰岛素抵抗和血清转氨酶升高[33-34]。给予小鼠含1.25%胆固醇和0.5%胆酸的致动脉粥样硬化饮食，6周后出现肝细胞脂肪变性和小叶炎症，血清ALT、总胆固醇、三酰甘油水平升高，24周后出现肝细胞气球样变和肝纤维化[35]。致动脉粥样硬化饮食可诱导肝脏氧化应激、血脂异常、脂质过氧化和星状细胞活化，不会引起体重增加及明显的胰岛素抵抗，高脂肪成分可促进NASH的病理学进展。综上，致动脉粥样硬化饮食能够复制人类NASH的病理学特征，但代谢变化不同于人类NASH。

3 高温加工食物在NAFLD中的致病作用

食物在高温加工过程中可产生大量自由基，其中活性氧可与生物膜磷脂、多不饱和脂肪酸、核酸等大分子起过氧化反应，引起脂质过氧化，并通过链式反应放大活性氧的作用，导致线粒体膜损伤，膜流动性下降，引起肝脏损害。高温烹饪如烘烤、焙烧、油煎和烧烤是晚期糖化的强效启动子，高温烹饪食物过程中可生成晚期糖基化终产物(advanced glycation end products，AGEs)，即在没有酶参与的条件下，蛋白质、脂质或核酸等大分子自发与葡萄糖或其他还原性单糖反应生成稳定的共价加成物。体内AGEs主要有两个来源：一是过量的糖与蛋白质在体内合成AGEs；二是摄入食物中的AGEs。AGEs与糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病等疾病及人体衰老密切相关[36]。与健康人群和单纯性脂肪变性患者相比，NASH患者AGEs含量增加，且与胰岛素抵抗呈正相关，与脂联素水平呈负相关，减少AGEs的摄入可减轻胰岛素抵抗和氧化应激，减轻血管内皮功能障碍[37-38]。此外，AGEs的可溶性受体(soluble receptor for AGEs，sRAGE)可阻止胞外AGEs与细胞表面的RAGE结合，发挥保护作用[39]。哥本哈根大学的Mark等[40]研究发现，高AGE饮食可增加胰岛素抵抗的发生，调整烹饪方法可减少AGEs的产生，摄入过量高温加工处理的食物可导致AGEs暴露量增加。研究发现，食物中提取的AGEs能够诱导体外氧化应激和炎症反应[41]，提示食物中的AGEs是体内的促氧化剂。氧化应激及其他有害刺激可引起Jun N末端激酶(JNK)激活，导致胰岛素受体底物(IRS)失活，JNK激活是NASH中胰岛素抵抗、脂质细胞凋亡和纤维化的影响因素[42-43]。在氧化应激过程中，随着活性氧(ROS)的过量产生，细胞抗氧化能力降低。核因子E2相关因子2(Nrf2)可诱导氧化应激反应[44]，激活多种抗氧化反应元素，包括NAD(P)H、醌氧化还原酶-1、谷胱甘肽转移酶和谷氨酸半胱氨酸连接酶[45]。NAFLD患者肝组织中的Nrf2可上调抗氧化酶的表达。Nrf2-/-蛋氨酸和胆碱缺乏饮食小鼠脂肪沉积、肝脏谷胱甘肽水平降低、脂质过氧化增加均较野生型小鼠明显[46]，脂肪性肝炎较野生型小鼠严重，且进展迅速，表明Nrf2可能是治疗NAFLD的潜在靶点[47]。目前，尚未发现高温加工食物导致NAFLD的动物模型，结合人们的日常饮食，研究高温加工食物诱导NAFLD的动物模型对阐明NAFLD的发病机制具有重要意义。

4 展 望

饮食因素在代谢性疾病的发生发展中起极其重要的作用，改变生活方式是管理NAFLD及其他慢性病的最重要选择，60%的患者可通过干预生活方式逆转NAFLD。人体是一个复杂开放的自组织、自调节、自稳定的生物系统，对环境充分开放并不断获得物质、信息，进行能量交换，维持动态稳定。人体摄入的食物承载着能量和信息，直接或间接影响人体的代谢和功能，如西方膳食(即高脂肪、高蛋白、高盐、低纤维膳食)、精制食品等可引起营养过剩和过氧化(自由基)损伤，导致慢性代谢性炎症、糖尿病、高血压、高脂血症、高尿酸血症、痛风等疾病，若改变饮食结构，则可减轻或逆转上述共患疾病。目前NAFLD的发病机制尚未完全阐明，开发符合人类饮食规律的新型模型对进一步研究NAFLD的病因、发病机制、诊断和治疗具有重要意义。