代谢组学生物标记物在儿童支气管哮喘中的作用

陈晓彬，万力生*，李佳曦，陈争光

（1.遵义医科大学珠海校区，广东 珠海 519041；2.深圳市儿童医院，广东 深圳 518026）

支气管哮喘（bronchial asthma）简称哮喘，是由多种细胞及细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[1]。该病可发生于任何年龄，但以小儿较为常见，且是常见的儿科急症之一[2]。研究发现哮喘疾病患儿的治疗费用成为了各个国家卫生部门支出中相当庞大的一部分，该病对儿童的身心健康产生了严重的危害。因此，哮喘疾病是关联个体或者特殊群体而存在的问题，逐渐引起政府及卫生事业研究者的高度重视的社会问题。

代谢组学是近年来一门新兴的学科，以分析机体产生的小分子代谢产物（分子量＜1 000 Da），了解这些小分子物质在某种疾病状态下的终末变化过程，进而揭示其在该疾病状态下的动态过程及调控规律[3]。该学科更加强调应用整体及动态的观点来研究疾病，这与中医学的整体、系统和辨证论治思维高度契合。在支气管哮喘患者中，不同疾病阶段其代谢终末产物可能存在一定差异。另外，该检测手段具有更高的准确性及灵敏度，并将统计学分析融入其中，通过一次检测分析可找出多个可能与疾病相关的生物标志物。因此，可将其作为该病的生物标记物，动态的了解该病的发生、发展、严重程度评估、疗效评价及预后。

中医学辨证论治为中医之根本，从中医的角度出发，哮喘疾病的机制可从“风邪”论、“痰”论、“痰瘀互结”论、“腑脏”论等多个方面进行分析[4]。疾病的证型主要依靠患儿疾病的临床表现，除外还需依靠医者个人丰富的临床诊疗经验进行鉴别，中医证型的分辨对小儿哮喘疾病的诊疗及机制研究提供了更广阔的思路，但是在小儿支气管哮喘疾病的病因和机制研究中缺乏一定的客观标准，中医理论与代谢组学研究方法的结合，为中医学在小儿支气管哮喘的病因及机制研究中开辟了新的思路。

1 代谢组学的定义及研究技术

代谢组学（metabonomics）是由 Nicholson 及其同事于1999年首次在已有的基因、转录和蛋白组学之后的一门创新性组学分支[5]，主要是通过分子生物学技术对低分子代谢产物（一般分子量小于1 000）进行定性定量分析。针对不同的研究个体以及研究结果，可以大致将代谢组学分析层次总结为代谢靶向目标分析、代谢指纹图谱分析、代谢轮廓分析以及代谢组学分析4个研究层次[6]。其研究流程包括样品的采集和处理、定性定量分析、数据处理、相关生物标记物继代谢途径的寻找、生物学意义的获取等[7]。每一种技术都有各自的有点，为了更大地发挥其优点，把多种技术联合应用到对生物代谢的分析中，其中以核磁共振、液相色谱—质谱联用技术、气相色谱—质谱联用技术应用最为广泛[8]。

2 代谢组学中生物标记物的研究进展

代谢组学的研究标本具有多样性，人本身作为一个不断运行的机体，参与机体代谢活动的各类组织液如血液、尿液、唾液等都处于动态的更替中，包括机体的细胞内液、细胞中微小结构以至于机体组织等都含有大量的机体代谢产物，这些代谢产物在机体受到外界刺激发生疾病或创伤的状态下，都可以适时的反应出机体内的微观变化并体现于整体，为研究疾病的发生、发展提供大量信息[9-10]。尿液本身作为机体通过复杂的转换与代谢后排出体外的一类“废液”，标本收集简单无创，临床较易获得，用于疾病的研究相对简便且更有意义。CARRARO S等[11]采用液相色谱质谱联用仪分析，观察哮喘组大鼠与正常组大鼠尿液的代谢组分变化，发现乳酸、柠檬酸等代谢产物在肝郁证哮喘组大鼠的尿液中较正常组是减少的，而乙酰乙酸、肌酸酐等 7 种代谢产物的含量则是增多的，从而初步分析出能够反映哮喘组代谢特征的生物标记物，为肝郁证哮喘的作用机制、作用靶向点提供了依据。体质存在能量代谢、氨基酸代谢及糖代谢的差异。

呼气冷凝液是人们呼气后产生的一种高度稀释的体液，其检测具有无创伤、易操作、可反复进行等优点，在儿童的肺部疾病研究中高度可行。现已有研究证实呼气冷凝液的 NMR 谱可以区分出哮喘儿童和健康儿童，其精确度为 86%。IBRAHIM B等[12]通过呼气冷凝集液的 NMR 分析哮喘患者与健康组小分子代谢产物的差异性分布发现，不同表型的哮喘其小分子代谢产物分布存在差异性，因此可分为嗜酸性粒细胞增多型、中性粒细胞增多型、哮喘控制型和使用糖皮质激素治疗的哮喘型等。

综上所述，在支气管哮喘发作的病程中，获得生物体体液或血液等样本，利用代谢组学技术进行检测其中的生物标记物，寻找出具有生物学意义的差异性标志物，通过这些差异性代谢产物找到与之相对应的代谢通路，经过进一步研究与分析其中的关系，成为甄别中医证型的客观性向导。目前越来越多的学者已发现一些与支气管哮喘疾病发作机制相关的代谢通路及特异性生物标记物，这些研究的成果都为进一步的探索支气管哮喘的病理生理机制，以及对指导个体的治疗和预防有着极其重要的意义。

3 代谢组学技术在支气管哮喘疾病中的研究

随着医学研究技术的进步，代谢组学这项新兴研究分析技术的快速发展，逐渐形成了从上至下的系统生物学研究方法，广泛运用于各种疾病的研究。收集支气管哮喘儿童的外周血液、大小便、呼气冷凝液、肺泡灌洗液等标本并测定，以发现其特定的生物标记物，通过对其进行定性及定量分析，寻找与标记物相关的代谢途径，并分析其发病过程中特定标志物的变化过程，最终获得其生物学意义及可能存在的发病机制，为该病的诊治、疾病评估、疗效分析及预后提供理论依据。

VERCELLI D[13]通过构建小鼠哮喘模型表达芯片谱精氨酸酶I 和精氨酸酶II 浓度高低与哮喘的炎症介质IL-4 和IL-13 表达具有相关性，因此可推断哮喘的发病机制可能与精氨酸通路密切相关。PETERSGOLDEN M等[14]发现花生四烯酸代谢通路与支气管哮喘急性发作高度相关，并可作为疾病严重程度的特异性标志物。李永霞等[15]通过检测支气管哮喘患者急性发作期与缓解期两个不同时期患者血清中的8-异前列腺素水平，证实急性发作期血清中的 8-异前列腺素明显升高，而经治疗后其水平可显著降低，但都仍高于正常组患者。因此，8-异前列腺素可作为评价该病严重程度及疗效的生物标志物 。

4 代谢组学技术在支气管哮喘中医方向的研究

中医证候是指对某种疾病在某一发展阶段的起病原因、发生机制、疾病性质等的概括性描述。利用代谢组学，可以更加完全的反映出疾病的内在围观变化，使“证候”得到客观、定性、定量的描述，从而促进中医证候本质的研究。由于生物体在不同生理及病理阶段有着特殊的代谢模式，有学者运用代谢组学技术研究中医证侯，找到与支气管哮喘发病机制可能相关的代谢通路，筛选出与“证型”相关的特异性生物标记物，为中医证型的区分提供了理论基础。代谢组学采用了一种接近身体内环境的方法，利用身体机能受到外界刺激而产生的代谢产物及废物的变化，对生物体进行的一种无损伤研究，打破了传统检验方法的局限性，利用某一些特异性的生物标记物，找到完整的代谢通路，建立起一个相对完整的疾病发生时生物体的病理生理改变，更加系统的阐述了疾病的发生、发展以及对治疗和防治的重要意义，这与中医学的“整体观”和“动态观” 相似，代谢组学作为一种新的研究手段与中医学相结合，微观上从小分子代谢物，宏观上从整体代谢通路延伸至疾病机制，为中医证候的甄别添加了更具有说服力的客观证据。

牛晓曼等[16]运用1-HNMR代谢组学方法研究脾虚型痛风患者粪便中的生物标记物，得出与正常健康人相比较，其中丁酸、丙氨酸、牛磺酸等生物标记物含量有明显变化，与非脾虚型的痛风患者相比，其中异亮氨酸、亮氨酸等代谢物含量具有差异。周贤梅等[17]选择肺癌痰湿蕴肺证、气阴两虚证患者与健康志愿者的呼气冷凝液为标本，利用气相色谱—质谱(GC-MS)技术分析呼气冷凝液代谢产物，发现了 9 种潜在的可能与肿瘤疾病相关的代谢标志物，其中 3 种为2个实验组特有化合物，6 种为3个实验组共有化合物；3-氨基-2-苯甲酰基-4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩为痰湿蕴肺组特有化合物，1-(苯基磺酰基)吡咯为气阴两虚组特有化合物。得出呼气冷凝液中存在着对肺癌具有诊断意义的代谢产物，肺癌不同中医证型的临床客观化指标的研究的可能性。陶嘉磊等[18]运用气相色谱与质谱联用技术（GC-MS/MS），分析小儿支气管哮喘发作期痰热阻肺证、非痰热阻肺证尿液代谢物，发现与非痰热阻肺证患儿相比，痰热阻肺证患儿尿液中的草酸、L-苏氨酸、嘧啶等 9 种物质含量下降，主要涉及戊糖磷酸途径，肌醇磷酸代谢等 4 条代谢通路，从而得出，支气管哮喘发作期不同证型间存在代谢标记物与代谢通路基础。吴泽明等[19]通过液相色谱—质谱联用技术对维吾尔医异常黑胆质证哮喘患者的血清中的代谢产物进行研究，筛选出可能与异常黑胆汁型哮喘发生相关的 15 个代谢产物，是维吾尔医在支气管哮喘的诊治过程中有了可靠的依据。陈黎等[20]利用GC/MS代谢组学技术通过研究小儿哮喘患者尿液中的代谢产物，发现与正常小儿相比，哮喘患儿尿液中的磷酸盐、L-苏氨酸、L-脯氨酸等18种代谢物存在明显的差异，通过分析代谢通路，得出能量代谢、氨基酸代谢等代谢通路可能与哮喘疾病发病机制相关。苟小军等[21]采用气相色谱、质谱技术检测儿童哮喘肺脾气虚型、气阴两虚型患者以及正常儿童的尿液中中小分子代谢物，利用代谢物谱库得出儿童哮喘2种“证型”患者间尿液中的丁酸、磷酸盐、L-苏氨酸、肌酐、甘氨酸、D-葡萄糖、马尿酸、假尿苷的相对含量存在显著差异，这些代谢物与能量代谢、肠道菌群代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢异常相关，它们是区分这2种中医证型的潜在生物标记物。

综上，代谢组学技术从微观分析到宏观概括也可以与中医理论相结合，应用于不同证型的支气管哮喘患儿的研究，为哮喘疾病的辨证论治、探索病症间的内在联系以及对疾病的预防提供了更深层次的依据。

5 小结

儿童支气管哮喘是儿童常见的急症之一，其反复发作仍是危害儿童身心健康的重要原因。近年来儿童哮喘的发病率及致残率均有显著升高，因此，早期诊断及合理的管理该疾病对降低其致残率至关重要。目前，在国内外都已经有众多学者开始利用代谢组学技术进行支气管哮喘疾病的研究，而中医是属于祖国的特色医学，代谢组学生物标志物可帮助解决这一关键问题，通过对哮喘患者的代谢废物或代谢产物的特定生物标志物进行检测，可了解该病的诊断、分析、疾病活动度、严重程度及疗效等，更简洁、方便及无创的对哮喘患者进行管理，这将对该类患者的诊疗及管理起到至关重要的作用。