外泌体在骨再生及骨疾病领域的研究进展

杨 烁，温 宁

解放军总医院第一医学中心 口腔科，北京 100853

近年来，以干细胞为基础的组织工程技术在骨缺损修复与再生领域中展现了良好的修复效果以及广阔的应用前景。但是干细胞治疗的局限性也受到越来越多的关注，如伦理限制、免疫排斥反应、突变致瘤性等[1]。最近的研究表明外泌体具有与其来源细胞相似的生物学效应，可以作为间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)的替代物应用于骨组织修复，从而规避直接使用干细胞带来的风险，实现“无细胞治疗”[2]。另外，外泌体也可介导细胞间通讯，在骨疾病的发生、发展以及诊断中扮演重要角色[3]。本文就外泌体在骨再生及骨疾病领域的研究做一综述，以期为外泌体的临床应用提供参考。

1 外泌体对骨缺损修复与再生作用

外泌体是细胞囊泡的一种，最早于1983年在网织红细胞中被发现，并在1987年被命名为“exosome”[4]。外泌体的直径为30 ～ 150 nm，可由多种细胞(如间充质干细胞、树突状细胞、上皮细胞、脂肪细胞、B细胞)所分泌并广泛存在于血液、尿液、唾液等体液中[5]。外泌体的结构主要是磷脂双分子层及其所包含的内容物如mRNA、miRNA、DNA、脂质和蛋白质等[6]。外泌体可以将其内容物转运至靶细胞，从而发挥细胞间通讯的作用，同时影响细胞的微环境并调节细胞相应的生理功能。目前的研究表明，外泌体不但能参与组织的修复再生，还在疾病诊断、肿瘤的侵袭与转移、免疫调节以及药物靶向运输等领域发挥作用[7]。

骨重建是维持骨代谢平衡的关键。在骨重建中涉及到许多与骨相关的细胞，如骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、成骨细胞、破骨细胞以及骨细胞[8]。除了骨相关细胞，其他细胞系统如免疫细胞(T细胞，树突细胞和单核细胞)以及血管内皮细胞在骨重建中同样发挥重要作用[9]。鉴于骨重建是一个复杂的过程，如何控制这些细胞之间的通讯对骨再生是极其重要的环节。细胞间通讯的一种途径是通过细胞间直接接触来传递信号并调节相应的生理功能，另一种途径则是通过体液循环中一些可溶性介质来进行信号传递[10]。目前的研究表明外泌体在信号传递中发挥重要作用，能够影响多种细胞的功能来参与骨组织的修复与再生[11]。

1.1 外泌体促进BMSCs成骨分化 研究表明，外泌体内的miRNA在MSC成骨分化的过程中发挥重要作用。对MSC来源外泌体的miRNA分析表明，在MSC成骨细胞分化过程中9个miRNA(let-7a，miR-199b，miRNA-218，miRNA-148a，miRNA-135b，miRNA-203，miRNA-219，miRNA-299-5p和 miRNA-302b)被 上 调，5种 miRNA(miR-221，miR-155，miR-885-5p，miR-181a和 miR-320c)被下调，以上这些miRNA都在成骨分化以及矿化中发挥作用[12]。Narayanan等[13]提取了经过成骨诱导后BMSCs的外泌体，并将其加入到hBMSCs培养基中，结果表明，在2D培养条件下外泌体可以促进BMP9及TGF-β1基因的表达；而在3D培养条件下，外泌体可以促进OCN、RunX2基因的表达。除了BMSCs之外目前还有多种MSC来源的外泌体被证明在BMSCs成骨分化中发挥作用。如人诱导多能干细 胞 (human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)、人脂肪间充质干细胞(human adipose mesenchymal stem cells，hAMSCs)来源的外泌体等[14-15]。

1.2 外泌体调节成骨细胞的增殖和活性 外泌体可以通过调节成骨细胞的增殖和活性来促进骨再生。研究表明，MSC来源的外泌体可以直接被成骨细胞摄入，促进成骨细胞的增殖并诱导GLUT3和MAPK通路相关蛋白的合成[16]。Lu等[15]研究发现hAMSCs来源的外泌体可以促进人成骨前体细胞的增殖和迁移，并且可以上调成骨相关基因Ⅰ型胶原、OPN、RunX2等的表达水平。此外，外泌体还可将miRNA(如miRNA-196a)转运至成骨细胞，并对成骨细胞的增殖和活性产生影响[17]。研究发现从高度矿化的MC3T3-E1细胞提取的外泌体中有43个miRNA高表达，包括miR-30d-5p、miR-133b-3p和miR-140-3p，这些miRNA在功能上被确定参与调节骨组织的重塑过程，并被认为可以通过调节Wnt、TGF-β和钙离子信号通路，参与成骨细胞的分化和多种生理功能[18]。

1.3 外泌体促进细胞外基质的矿化 骨再生中骨基质矿化是一个十分重要的生理过程。Narayanan等[13]研究发现MSC来源的外泌体可以直接结合于细胞外基质中的蛋白(如Ⅰ型胶原及纤连蛋白)从而促进细胞外基质的矿化。Qi等[14]在体外研究中发现，hiPSCs来源的外泌体可以促进骨质疏松大鼠BMSCs的增殖，提高其成骨分化过程中ALP活性及Ⅰ型胶原、OPN、RunX2等基因的表达水平，并促进骨基质矿化。此外，有研究发现前列腺癌细胞来源的外泌体可将人成骨细胞的增殖活性提高1.5倍，提高ALP活性并促使其产生更多的钙沉积物[19]。

1.4 外泌体促进血管新生 血管新生在骨再生过程中发挥着重要的生理功能。新生血管不仅可以运送氧气和重要的营养物质，还可以促进细胞增殖及骨基质矿化[20]。Zhu等[21]在体外研究中发现hAMSCs来源的外泌体具有促进血管生成的作用，通过进一步分析发现，该外泌体中包含了对血管内皮细胞增殖及血管形成有重要调节作用的miRNAs(miR-126、miR-130a和miR-132)。在另一项体外研究中，研究人员发现人胎盘MSC来源外泌体可以通过促进血管内皮细胞增殖、迁移来促进血管形成[22]。另外，Liu等[23]研究发现hiPSCs细胞来源的外泌体可以通过激活PI3K/Akt通路来促进血管内皮细胞的增殖、迁移及成血管作用。体内研究中，Xie等[24]将大鼠BMSCs来源外泌体与组织工程支架材料结合，结果发现其能够有效促进骨再生及血管再生。Zhang等[25]将人脐带间充质干细胞来源外泌体用于大鼠骨折模型中观察其对骨折的愈合效果，结果表明外泌体能够通过促进缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子的表达来促进血管形成，进而加速骨折愈合。

2 外泌体在骨疾病中的作用

骨形成和骨吸收是维持骨代谢平衡的关键。当这个平衡被打破之后就会发生很多与骨相关的疾病。多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种恶性溶骨性骨疾病，它的特征是破骨细胞活性过高和成骨细胞活性不足。骨髓来源的细胞与MM细胞之间的通讯在骨质吸收和肿瘤进展中发挥了重要作用[26]。MM细胞来源的外泌体能够促进破骨细胞的募集以及破骨活动的进行，同时MM患者的BMSCs来源外泌体能够促进骨髓瘤的增殖，而健康人来源的BMSCs外泌体则能抑制MM细胞的增殖及血管生成[27]。

骨质疏松症是一种常见而严重的疾病，它的特点是骨密度下降，患者骨折风险增加。外泌体可以通过影响骨代谢过程而影响骨质疏松进程。破骨细胞外泌体中的miR-214-3p能够影响成骨分化以及骨形成[28]。Yavropoulou等[29]研究发现骨密度较低的绝经后妇女血清中的miR-21-5p水平要低于对照组妇女。此外，在一项研究中学者发现骨质疏松患者以及小鼠血清中破骨细胞来源外泌体的miR-214表达显著高于正常人及小鼠，该研究发现miR-214可通过外泌体作用于成骨细胞并抑制其成骨活性[30]。

骨关节炎(osteoarthritis，OA)同样是骨科的一种常见病，它的特征是严重的关节软骨退行性变，在女性中非常普遍。OA的早期诊断较难，而且目前针对OA的治疗方案也比较有限。滑膜液主要位于关节腔内，能够与关节软骨直接接触。研究认为滑膜液参与了OA的病理过程[31]。最近的研究已经开始关注滑膜液中外泌体在OA的发生以及早期诊断中所发挥的作用。研究表明，当OA患者滑膜液中外泌体被关节软骨细胞内吞后，细胞会低表达与软骨基质形成相关的基因如蛋白聚糖、Ⅱ型胶原，高表达炎症相关基因如IL-6。此外，OA患者外泌体中miRNA的含量也展现出性别特异性。女性患者中有许多与雌激素反应相关的miRNAs，如 miR-181d-3p、miR-185-5p以 及 miR-7107-5p，这也预示筛查这些性别特异性miRNAs可作为早期诊断OA的途径[32]。

3 外泌体的应用与挑战

鉴于外泌体在组织再生以及细胞通讯中的重要作用，其具体应用开始受到越来越多的关注。在骨组织工程中，越来越多的研究开始用外泌体代替间充质干细胞来进行骨修复。相比于直接应用干细胞进行治疗，外泌体具有以下有点：1)安全性高。外泌体治疗可以避免直接应用干细胞所产生的突变致瘤、免疫排斥及血管栓塞等并发症的风险。2)易于运输及保存。外泌体膜结构能够保护其内容物，在体外-80℃条件下可以长期保存且不损失效力。3)免疫原性低。外泌体可以跨质膜运输，极少发生免疫排斥反应。4)作用效率高。外泌体可以直接被靶细胞摄入并作用于靶细胞，发挥相应的生物学效应[33-34]。Qin等[17]将BMSCs来源的外泌体注射到大鼠颅骨缺损模型中来观察骨修复效果，结果表明颅骨缺损的愈合明显加快。Qi等[14]将hiPS来源外泌体与β-磷酸三钙支架材料相复合用于修复大鼠颅骨缺损，结果表明外泌体复合支架材料组的修复效果要明显好于单纯的支架材料组，作者通过进一步研究发现，外泌体可以通过激活PI3K/Akt信号通路来促进BMSCs体外成骨效果。Li等[35]将聚多巴胺修饰的PLGA材料作为载体负载人脂肪间充质干细胞来源的外泌体来进行骨修复，也取得了不错的成骨效果。

除了在组织工程中的应用，由于在病理状态下外泌体内容物的表达水平与正常状态有所不同，再加上外泌体易于收集且较稳定的特点，利用外泌体作为早期骨骼疾病的诊断成为一种可能。外泌体同样可以被作为一种治疗方法用于某些疾病的治疗，如当骨质疏松患者发生骨折时，BMSCs来源的外泌体可以通过转运miRNAs(如miR-21、miR-4532及miR-125b-5p)来加速骨折的愈合[36]。此外，由于外泌体具有纳米化尺寸、高生物相容性以及与细胞膜特异性结合的能力，可以把外泌体作为特异性药物的运输载体来靶向治疗特定疾病。如位于外泌体表面的EphrinA2能够特异性结合成骨细胞表面受体，在骨质疏松患者中可以通过向外泌体中加载治疗药物如甲状旁腺激素来调控患者成骨细胞的功能进而达到治疗目的[30]。

尽管外泌体在骨再生及骨相关疾病的诊断及治疗等方面开辟了新的研究领域，但是其具体应用中仍有许多问题等待我们去解决。如何提取高纯度的外泌体来保证诊断的准确性以及提高治疗效果是目前面临的难题，目前的提取方法如超速离心、密度梯度离心以及试剂盒法等都不能最大限度地提高外泌体的纯度。此外，如何提高外泌体的靶向运输能力以及提升外泌体的作用效率也是目前外泌体疗法应用的关键。因此外泌体的临床应用还需要更多的探索。