月季高效增殖和生根条件的优化研究

王艺程 杨柳燕 张永春 杨 玲

（1上海市农业科学院林木果树研究所，上海市奉贤区 201403；2上海源怡种苗股份有限公司，上海市浦东新区 201204）

月季是蔷薇科蔷薇属木本植物，原产于中国，具有很高的观赏价值，被誉为花中皇后，深受人们喜爱。但月季为木本植物，生长繁殖速度较慢[1]，而随着月季产业的发展，市场对月季种苗的需求量越来越大，传统的无性繁殖手段已无法满足市场需要。研究表明，月季的组培繁殖率远高于无性繁殖手段，且通过组培繁殖的新苗不仅能保留原品种的优良性状，且耗时短[2]。因此，诸多研究建立了以月季腋芽为材料、通过器官发生途径的快繁技术体系，以幼嫩叶片及合子胚为材料、通过诱导愈伤分化途径的再生体系，以叶片和茎段为材料、通过月季体细胞胚胎发生途径的快繁技术体系，然而这些研究均存在组培苗再生频率低、组培技术体系不稳定等问题，因此优质种苗生产仍难以满足市场需求[3]。在此背景下，为进一步优化月季增殖和生根条件，提高月季增殖率和生根率，笔者在前期工作的基础上，对月季组培苗增殖和生根的最适培养基配方进行了筛选，以期完善月季的组培快繁技术体系，为实现其规模化、工厂化生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为诱导产生的月季试管苗，品种代号为“5002”。试验于2017年3月—6月在上海市植物种苗组培平台组培室内进行。

1.2 试验方法

1.2.1 月季离体增殖技术

供试材料为初代诱导产生的月季试管苗。增殖培养以MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA（6-苄基腺嘌呤）、NAA（萘乙酸），另加蔗糖30 g/L、琼脂4 g/L，共设9个处理，见表1。

表1 月季增殖培养基中激素配比

选取苗高≥2.5 cm的月季试管苗，用解剖刀切成长0.5～1.0 cm的茎段，每个茎段都带有1张叶片，区分好植物形态学上下端，然后垂直接种于培养基上。每个处理接种20瓶，每瓶接种5个茎段。在培养室内进行光照培养，培养温度为(25±2) ℃，光照时间12 h/d，光照强度1 000～2 000 Lux。

每隔3 d观察1次，去除被污染的外植体，培养45 d后，统计增殖情况，即统计试管苗个数，测量其高度、叶长、叶片数、茎粗，记录各配方最低苗高和最高苗高并进行比较，计算增殖系数和平均高度、平均叶长、平均叶片数、平均茎粗，观察生长状况等。

计算公式：增殖系数=试管苗个数÷发生增殖的外植体数，平均高度=∑各苗高度÷试管苗个数，平均叶长=∑各苗叶长÷总叶片数，平均茎粗=∑各苗茎粗÷试管苗个数，平均叶片数=∑各苗叶片数÷试管苗个数。

1.2.2 月季试管苗生根试验

供试材料为增殖培养产生的月季试管苗。生根培养以1/2 MS为基本培养基，添加不同浓度的NAA和AC（活性炭），另加蔗糖30 g/L、琼脂4 g/L，共设9个处理，见表2。

表2 月季生根培养基中NAA和AC浓度配比

在超净工作台上用解剖刀将继代增殖培养产生的试管苗（苗高≥2.5 cm）一株一株分开，接种于9种不同激素配比的培养基上。培养条件同1.2.1。每个处理接种20瓶，每瓶接种5株增殖苗。

每天观察各培养基上试管苗的生根情况，培养38 d后统计生根指标数据，即统计每个处理生根试管苗数、各苗根数，测量根长、根粗、第三节高度（由上往下数第三节）、叶长，计算生根率、平均根长、平均根数、平均叶长、平均根粗、第三节平均高度。

计算公式：生根率=（生根苗数÷接种苗数）×100%，平均根长=总根长÷生根外植体数，平均根数=总根数÷生根外植体数，第三节平均高度=∑各苗第三节高度÷外植体数，平均叶长=∑各苗叶长÷总叶片数，平均根粗=∑各苗根粗÷各苗总根数。

1.3 统计分析

运用SPSS 19.0数据统计分析软件进行数据分析。采用ANOVA 9（方差分析）对处理间进行差异性测验，采用邓肯氏新复极差法进行多重比较分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同增殖培养基上月季试管苗的增殖和生长情况

由表3可知，培养基配方中不同浓度的6-BA与NAA组合对月季试管苗的增殖影响存在差异。在6-BA为0.5 mg/L时，随着NAA浓度的升高，增殖系数呈先下降后升高的趋势;在6-BA为1.0 mg/L时，随着NAA浓度的升高，增殖系数呈先上升后降低的趋势;在6-BA为2.0 mg/L时，随着NAA浓度升高，增殖系数呈先下降后升高的趋势。在NAA为0.1 mg/L时，随着6-BA浓度的升高，增殖系数呈先下降后升高的趋势；在NAA为0.2～0.3 mg/L时，随着6-BA浓度的升高，增殖系数呈先上升后降低的趋势。各处理间增殖系数差异达显著水平，G2处理的增殖系数最低，为1.29，且G2处理的试管苗有黄叶和愈伤组织，叶片小；G1处理和G9处理的增殖系数虽较高，但G1处理的试管苗有少量黄叶，且基部有愈伤组织，G9处理的试管苗畸形，叶弯曲，且部分苗的基部有愈伤组织；G5处理的增殖系数最高，为2.71，且G5处理的试管苗正常生长并生长健壮。

经综合考虑，以G5处理，即以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂4 g/L为月季试管苗的最佳增殖培养基配方。

表3 不同增殖培养基上月季试管苗的增殖和生长情况

2.2 不同生根培养基上月季试管苗的生根和生长情况

由表4可知，培养基配方中不同浓度的NAA与AC组合对月季试管苗生根及生长的影响存在差异，加入活性炭对月季试管苗生根有促进作用。在NAA浓度为0.5 mg/L时，随着AC浓度的升高，平均生根率呈下降的趋势;在NAA浓度为1.0 mg/L时，随着AC浓度的升高，平均生根率呈先下降后升高的趋势;在NAA浓度为2.0 mg/L时，随着AC浓度的升高，平均生根率呈下降的趋势。S5处理的平均生根率最低，为68%；S4处理和S6处理的平均生根率最高，均为100%，但S4处理的试管苗根细长且根系脆、易断，有少量枯黄叶和少量侧根，S6处理的试管苗有少量褐枯黄叶，叶卷曲；S1处理的平均生根率排名第2，达98%，但试管苗叶色有枯黄，有少量侧根，且根系易断；S7处理的平均生根率排名第4，达96%，试管苗根长、粗壮，仅有少量黄叶，但根易断，且根系有部分褐色；S2处理的平均生根率达94%，仅有少量褐枯黄叶，且根系有弹性，不易断，更适于移栽成活。

经综合考虑，以S2处理，即以1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+AC 1.0 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂4 g/L为月季试管苗的最佳生根培养基配方。

3 结论与讨论

3.1 激素对月季试管苗增殖的影响

细胞分裂素有抑制植物顶端优势的作用，因而能促进侧枝的萌发和生长，主要是影响腋芽的增殖。生长素最主要的作用是促进生长，促进作用因浓度而异，较低浓度促进生长，较高浓度抑制生长[4]。曹伟杰等[5]的研究结果表明，月季品种“红双喜”丛生芽增殖的最佳培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L，6-BA和NAA对月季丛生芽的增殖起着协同作用，6-BA能促进丛生芽萌发，而适量NAA能使丛生芽生长健壮，但过高的6-BA会诱发芽苗玻璃化。在月季组织培养过程中，激素配比除了要考虑增殖系数外，还应考虑不定芽的质量，增殖系数过大，往往会伴随发生芽生长细弱、节间拉长等现象，出现不易生根或移栽成活率下降等问题。同时，生长素浓度较高会抑制细胞分裂，使某些芽的萌发受到明显抑制[6]。谢晓静等[7]以现代月季主栽品种“博”的茎段为外植体进行研究，BA和IBA的合适浓度配比，对月季侧芽的发育、生长均有促进作用；张宇斌[8]的研究结果表明，增殖培养基的最佳激素浓度为MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.4 mg/L。此外，细胞分裂素(6-BA)与生长素(NAA)的比值较低时，可诱导根的分化，两者比值适中时，可产生愈伤组织，两者比值较高时，可诱导芽的分化。

表4 不同生根培养基上月季试管苗的生根和生长情况

本试验结果表明，月季“5002”试管苗的最佳增殖培养基配方为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂4 g/L，在此培养基上诱导出的丛生苗长势较强，叶片大小正常，颜色鲜绿，平均高度为2.67 cm，平均叶长为1.32 cm，平均叶片数为7.53张，平均茎粗为2.47 mm，平均增殖系数达2.71。

3.2 激素和活性炭对月季试管苗生根的影响

曹伟杰等[5]的研究结果表明，月季品种“红双喜”芽苗再生根的最佳培养基为1/2 MS+NAA 0.05 mg/L，NAA能促进再生根的诱导，然而，NAA浓度过高会导致再生根生长不正常，对瓶苗生长不利，尤其对瓶苗的后期移栽成活非常不利。因此，NAA适合浓度的确定，不仅要考虑芽苗的生根率和生根数，还要考虑瓶苗的移栽成活率[5]。而张宇斌[8]研究结果表明，月季组培苗生根的最佳激素浓度为NAA 0.5 mg/L，培养10 d就能诱导根的形成，其生根率为90%。本试验筛选出的最优生根培养基配方中加入的激素及浓度也是NAA 0.5 mg/L，这和张宇斌等的研究结果一致。

孙占育[9]认为活性炭对植物组织培养生根的作用主要表现在：可提供生根的暗环境，防止根系褐变，有利生根，也有利于提高培养苗体内的可溶性蛋白和总糖含量，能吸附植物生长调节剂与其他有机物等有利生根的物质。因此，在植物组织培养生根中，选择合适的活性炭浓度有利于生根。本试验结果表明，以在培养基配方中加入AC 1.0 g/L为较好，且加入活性炭处理的试管苗比没有加活性炭处理的试管苗根系更有弹性，颜色洁白，且更有利于移栽成活，表明在月季试管苗生根培养基中加入活性炭，对生根起到了促进作用，这与孙占育的研究结论一致。