间充质干细胞向髓核分化研究进展

牛永涛，谢 林，席志鹏，邓蓉蓉

1.南京中医药大学第三临床医学院研究生院，南京 230038 2.江苏省中西医结合医院骨科，南京 230038

椎间盘退行性变为下腰痛的重要原因之一[1］。非手术或手术治疗均不能彻底治愈椎间盘退行性变，且有复发的可能[2-3］。间充质干细胞（MSCs）具有体外扩增及分化成正常组织的潜能，在一定的诱导条件下可以向成骨、成软骨、成脂及髓核细胞分化，且具有免疫原性低和免疫调节性的特点[4-7］，一直是组织修复研究的热点。近年来，诱导MSCs向髓核分化，用于修复椎间盘退行性变备受关注，并且在体内及体外实验证实具有可行性[8-10］。本文回顾分析近年MSCs向髓核分化的相关研究，从常用髓核细胞鉴定表型及MSCs向髓核分化的诱导方式等方面展开分析，现综述如下。

1 常用髓核细胞鉴定表型

目前无特异性细胞表型可以确定髓核细胞。Lee等[11］的研究显示，Ⅱ型胶原蛋白（COLⅡ）、蛋白多糖、SOX-9是髓核细胞与软骨细胞共同具有的基因表型，鉴定髓核细胞主要参考这3种基因的表达差异。近年来，有学者试图通过比较软骨细胞与髓核细胞基因表达差异，寻找髓核细胞较为特异性的基因来区别两者，用以鉴定髓核细胞。Liu等[12］从6例接受腰椎融合术治疗的患者体内取出椎间盘组织，并成功分离出正常髓核细胞并培养。KRT18和KRT19为人类脊索特异性标志物，常作为鉴定髓核细胞的阳性标志物[13-14］。KRT19可作为髓核细胞鉴定的特有基因用于描述髓核细胞的特征[15-16］。PAX1与FOXF1作为鉴定髓核细胞新的阳性表型在MSCs向髓核分化研究中广泛应用，PAX1参与胚胎期调节椎间盘生成，FOXF1与椎间盘细胞生长、增殖有关，SHH信号轴激活PAX1、FOXF1的基因表达[17］。在一项髓核细胞与软骨细胞的比较研究中，发现髓核细胞中KRT18、KRT19、PAX1及FOXF1的含量远多于软骨细胞[18］。

2 MSCs向髓核分化方式

2.1 生长因子

细胞的生长因子在组织工程中发挥着重要作用，通过自分泌、旁分泌及内分泌促进MSCs向髓核分化。其中转化生长因子-β（TGF-β）家族广泛存在于组织细胞中，具有调节细胞生长、分化、凋亡及细胞外基质合成的作用。TGF-β家族在修复椎间盘退行性变中发挥着重要作用，研究表明，TGF-β具有促进MSCs向髓核分化的作用，修复发生退行性变的椎间盘，延缓椎间盘退行性变进程，降低髓核细胞的凋亡率[19］。Tao等[20］的实验研究中，骨髓MSCs被包封于葡聚糖/明胶水凝胶中的控释给药系统，以TGF-β3纳米粒为载体移植至发生退行性变的椎间盘，实验结果表明，TGF-β3具有诱导MSCs向髓核分化的作用，可帮助修复发生退行性变的椎间盘。骨形态发生蛋白（BMP）联合TGF-β1可促进MSCs增殖及糖胺聚糖（GAG）、蛋白多糖、COLⅡ、SOX-9、KRT19的表达增加[21］。此外，胰岛素样生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子等都具有促进MSCs分化的能力。椎间盘内具有多种生长因子，这些生长因子参与细胞的增殖及分化，在椎间盘退行性变的修复中发挥重要作用，正是这些生长因子的存在，使得MSCs移植修复发生退行性变的椎间盘成为可能。但是生长因子诱导MSCs向髓核分化修复发生退行性变的椎间盘确切机制尚不清楚，有待进一步研究。

2.2 共培养

MSCs与髓核细胞共培养可促进MSCs向髓核分化，有助于修复发生退行性变的椎间盘。Ouyang等[22］将人MSCs及人髓核细胞按1∶1共培养后，COLⅡ、蛋白多糖及GAG的表达增加。Arkesteijn等[23］将MSCs与髓核细胞共培养在海藻酸钠微球中，GAG的表达增加，在髓核细胞附近观察到蛋白多糖的沉积。Strassburg等[24］比较了MSCs分别与发生退行性变的髓核细胞及正常髓核细胞共培养，认为与发生退行性变的髓核细胞共培养更利于MSCs向髓核分化，蛋白多糖、COLⅡ、SOX-9表达较正常髓核共培养显著增加，同时增加了软骨源性形态发生蛋白1（CDMP-1）、TGF-β1、胰岛素样生长因子1（IGF-1）和结缔组织生长因子（CTGF）基因的表达。Lehmann等[25］把MSCs与正常髓核细胞共培养后，发现TGF-β1表达升高并参与细胞间通信。MSCs与髓核细胞相互作用，促进了MSCs的表达谱向髓核细胞基因型转化，可能是髓核细胞分泌的细胞因子刺激了MSCs向髓核细胞的分化，同时，MSCs可能对发生退行性变的髓核细胞具有营养作用。

2.3 低氧

椎间盘内是一个特殊的低氧环境，髓核细胞在特殊低氧环境下具有正常繁殖及更新的能力，有学者根据这一特性，在模拟的低氧环境下诱导MSCs向髓核分化。Hudson等[26］报道了MSCs在低氧（5%O2）和常氧下向髓核分化的实验结果，低氧条件促进MSCs向髓核分化，GAG及胶原蛋白表达增加。Stoyanov等[27］的研究显示，在低氧条件及TGF-5作用下，COLⅡ、蛋白多糖、KRT19及GAG表达增加，认为在低氧条件及TGF-5作用下更有利于MSCs向髓核分化。Feng等[28］在研究低氧和支架构筑对兔MSCs向髓核分化的影响时发现，在低氧三维支架中，COLⅡ、蛋白多糖、SOX-9及GAG表达增加，同时低氧诱导因子-1α（HIF-1α）增加，认为MSCs低氧三维支架可用于椎间盘内移植，修复发生退行性变的椎间盘。Cui等[29］采用低氧联合含有 TGF-β1的三维支架诱导MSCs向髓核分化，发现在低氧（2%O2）条件下，COLⅡ、蛋白多糖、SOX-9和HIF-1α表达增加，认为含TGF-β1的静电纺丝纳米纤维支架支持MSCs在低氧下向髓核分化，是髓核再生的一种较为合适的选择。Ni等[30］在低氧诱导胚胎源性干细胞向髓核细胞分化的研究中发现，低氧可促进MSCs增殖及向髓核分化，表现为髓核细胞标志物COLⅡ、蛋白多糖、SOX-9及HIF-1α表达增加。体外低氧条件模拟了椎间盘的低氧环境，在低氧微环境中，MSCs可向髓核表型分化，并且HIF-1α表达增加，进一步证明低氧环境促进MSCs向髓核细胞分化的可行性。

2.4 三维支架

支架材料可以为MSCs提供三维的生长环境，避免了单层细胞培养的弊端，使细胞间形成适宜的空间分布和良好的联系，提供特殊的生长和分化信号，维持细胞的定向分化并维持表型。Vaudreuil等[9］采用MSCs光聚合生物凝胶支架修复椎间盘退行性变，MRI示髓核的基质改善，组织学检查示 凝胶组细胞增多，椎间盘退行性变减轻。Thorpe等[31］将MSCs及水凝胶一起注射到退行性变的椎间盘，注射后水凝胶与周围髓核组织结合，促进了MSCs向髓核分化，可以恢复腰椎的力学功能。Smith等[32］将MSCs接种于三维互穿网络水凝胶的体外研究发现，蛋白多糖、COLⅡ和GAG表达增加。Naqvi等[33］比较藻酸盐和壳聚糖水凝胶中骨髓MSCs向髓核分化差异，结果显示，壳聚糖水凝胶可调节GAG和胶原的表达；与壳聚糖相比，海藻酸钠能更好地支持MSCs中GAG和COLⅡ表达。陈春等[34］介绍了采用明胶微支架装载MSCs移植治疗犬退行性变椎间盘比单纯MSCs移植疗效更佳。三维支架可对MSCs起保护和支持作用，相当于细胞外基质，三维支架结构可容纳更多的细胞，使细胞有更多的接触机会，增加了细胞间的信号传递。同时，利用三维支架作为载体，与MSCs一起注射移植，为微创治疗椎间盘退行性变提供了方便。但如何让三维支架具有良好的生物可降解性，并且在组织形成过程中逐步降解而不影响正常组织生长及功能，仍是目前亟待解决的问题。

2.5 其他

有学者给予MSCs一定的应力，促进MSCs向髓核分化。Gan等[35］发现，给予MSCs较低压缩负荷（5%）时，MSCs向髓核分化被促进，蛋白多糖、COLⅡ、SOX-9及GAG表达增加。Luo等[36］模拟微重力诱导MSCs向髓核分化，结果显示，微重力下蛋白多糖、COLⅡ、SOX-9的表达增加，MSCs向髓核分化得到促进。Yan等[37］将不同浓度丹酚酸b联合MSCs移植入新西兰家兔椎间盘内，发现8周后蛋白多糖、COLⅡ的表达增加，结果提示丹酚酸b（1～10 mg/L）联合MSCs移植修复椎间盘退行性变较单纯MSCs移植更有效。还有部分学者将MSCs应用于临床，如Henriksson等[38］将MSCs移植入4位志愿者退行性变的椎间盘中，发现COLⅡ及SOX-9表达增加，表明MSCs向髓核分化。

3 结语和展望

应用组织工程修复退行性变椎间盘已成为目前研究热点，各种方式诱导MSCs向髓核分化在一定程度上取得了效果。使退行性变的椎间盘再生是未来修复椎间盘退行性变的理想手段。但由于椎间盘特有的生物力学性能及生理环境，目前大部分研究尚停留在实验阶段，还不能应用于临床。另外，目前也没有确切有效的鉴定髓核细胞的方法，不能形成统一有效的鉴定标准，在髓核细胞鉴定方面尚有不足。由于大部分诱导MSCs向髓核分化的研究仅有纵向比较，少有横向的各种诱导方式之间的比较，故各种诱导方式之间差别目前尚不清楚，亦没有形成一套安全、有效、稳定的诱导方案。后续研究可考虑对各种诱导方案通过体内外实验进行横向比较，总结筛选出一套安全、合理、有效的方案，通过临床试验取得临床资料，再次总结优化，最终在临床推广。