骨肉瘤细胞脱逸化疗诱导的细胞衰老可重新增殖成瘤细胞

张 良，刘明永，刘 鹏，薛 鑫，张良民，郭乔楠，赵建华

(1.陆军军医大学 大坪医院 脊柱外科，重庆 400042；2.陆军军医大学 新桥医院 病理科，重庆 400037)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS) 是临床上比较常见且死亡率占第2位的恶性肿瘤，主要发生在青少年[1]。很多情况下，确诊骨肉瘤时已经是中后期，此时很难采取手术完全切除。通常会采取手术配合术前/术后化疗即新化疗技术进行治疗。虽然化疗近年来取得了巨大进展[2]，但新化疗方案还无法完全清除体内的肿瘤细胞，这些细胞，部分以细胞衰老的状态存活下来[3-5]。它们在长期存活的过程中，可能会脱逸细胞衰老状态重新进入细胞周期进行增殖，成为骨肉瘤复发的种子细胞，这方面的研究较少。本实验运用多柔比星(doxorubicin，DOX)诱导骨肉瘤细胞U2OS和MG63产生衰老的细胞为模型。观察衰老骨肉瘤细胞能否脱逸细胞衰老和重新增殖。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级(月龄6～7周)雄性BALB/C裸鼠(陆军军医大学实验动物中心，许可证号：11401300093570)。

1.1.2 细胞系：人骨肉瘤细胞系U2OS和MG63(中国典型培养物保藏中心)。

1.1.3 主要药品和试剂：一抗p-p53、p-Rb和GAPDH (Santa Cruz公司)；p-γH2AX是DNA双链断裂(DSBs)的分子标志分子，在细胞衰老时表达水平上升，一抗p-γH2AX(Beverly公司)。衰老相关的β-半乳糖苷酶染色试剂盒(碧云天生物研究所)，RPMI-1640、胎牛血清(FBS) 和0.25%胰蛋白酶-EDTA(Hyclone公司)。DOX(Pfizer公司)，其他试剂和药品(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 脱逸率：将U2OS和MG63以1×106个细胞接种于6孔板中，贴壁过夜，添加DOX终浓度为0.25 μmol/L，作用4 d，而后更换成不含DOX培养基继续培养。在培养过程中再次出现克隆增殖时计算脱逸率，脱逸率=克隆数/开始接种细胞数。

1.2.2 细胞计数：用0.25% 胰蛋白酶EDTA消化，使细胞分散成单个细胞，锥虫蓝染色排除死细胞，细胞计数板进行计数。

1.2.3 衰老相关的β-半乳糖苷酶染色：按试剂盒说明书对细胞进行衰老相关的β-半乳糖苷酶染色，染色16～20 h，在光镜下衰老细胞呈现蓝染。计数蓝染的细胞比例。

1.2.4 Western blot检测p-p53、p-Rb和p-γH2AX蛋白:提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度；取等量蛋白(50 μg)，上样，电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h；一抗抗体(1∶1 000)、GAPDH单克隆抗体(1∶5 000)4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次，每次10 min，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/小鼠IgG(1∶5 000) 室温孵育2 h，洗膜3 次，每次10 min；加显色剂，Chemi Doc XR+凝胶成像仪扫描成像，条带分析测定使用Image Lab程序。

1.2.5 软琼脂糖集落形成实验: 6孔板孔底首先铺上 1.5 mL 0.36%软琼脂糖，放置4 ℃冰箱中使之固化，在固化的琼脂糖上面，接种0.36%软琼脂糖和3.0×103个细胞的混合液。待上层固化后，置入培养箱中培养，培养14 d后，在相差显微镜下观察并拍照。

1.2.6 裸鼠成瘤实验: 在裸鼠的右腹股沟区皮下接种 0.1 mL细胞悬液 (1×107个细胞/mL)，肿瘤体积=[长(L)×宽 (W)] 2/2。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 DOX可诱导U2OS和MG63 SA-Gal 染色阳性和衰老相关蛋白p-p53、p-Rb和p-γH2AX

用0.25 μmol/L DOX持续作用U2OS或者MG63，从第2天开始出现SA-Gal 染色阳性细胞，到第4天达到平台期，这时超过90%的细胞呈SA-Gal染色阳性(图1A)。DOX持续作用可以导致U2OS或者MG63细胞中p-p53、p-Rb和p-γH2AX明显升高(P<0.05)(图1B)。

2.2 衰老的肿瘤细胞可以脱逸衰老重新增殖

DOX持续作用U2OS或者MG63 4 d后，90%以上的骨肉瘤细胞被诱导衰老。更换不含DOX的培养基连续培养细胞75 d后，观察到有细胞重新增殖(图2)，脱逸率为1.23% 100万。

2.3 逃逸衰老的细胞具有形成肿瘤细胞的能力

经过14 d的培养，衰老的细胞未形成明显的克隆，但是脱逸衰老的细胞具有形成克隆的能力 (图3)。裸鼠成瘤实验表明，在45 d前U2OS和MG63母细胞形成的肿瘤比脱逸衰老细胞形成的肿瘤大，然而55 d后脱逸衰老细胞形成的肿瘤要比其母细胞形成的肿瘤大(图4A)。将移植后55 d的肿瘤解剖，也明显观察到脱逸衰老组细胞形成的肿瘤明显大于其母细胞组(图4B)。

3 讨论

体细胞在体外培养时，经过一定次数分裂后会自动进入稳定和不可逆的分裂停滞状态，称复制性衰老。其原因可能与端粒随细胞分裂而进行性缩短有关。除端粒缩短外，如氧化应激、射线损伤、化疗药物及某些原癌基因激活等, 亦可诱导细胞衰老，称为应激诱导的过早衰老(SIPS)。它们具有相似的特征：如停止在G1或G2期、细胞扁平、细胞内颗粒增多、DNA 损伤反应激活、p53- p21waf1和p16INK4-Rb 通路激活，衰老相关的β-galactosidase (SA-β-Gal)染色阳性等[6]。

A.1×106U2OS and MG63 cells were incubated with DOX and the percentages of SA-β-gal-positive cells were also measured by at mentioned time points; B.phosphorylated of SIPS-related regulators cells were treated with DOX for 1 to 9 hours, and phosphorylated p53, Rb and γH2AX were measured by Western blot;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group

图1 DOX诱导骨肉瘤细胞U2OS和MG63 SA-Gal 染色阳性及衰老相关蛋白p-p53、p-Rb和p-γH2AX明显升高

A.U2OS or MG63 cell treated with DOX, 1×106cells were treated with DOX for 4 days, and then were cultured without DOX for up to 75 days, cells were counted every 5 days; B.representative images at different time point among groups

图3 琼脂糖形成实验观察到逃逸衰老细胞具有集落的能力

A.invivoevaluation of tumor formation 1×106parent U2OS or MG63 or SEOS cells were injected subcutaneously in nude mice, volume of tumors was calculated at setting points; B.representative images at different time point among groups;*P<0.05 compared with U2OS or MG63 group at the corresponding time

骨肉瘤常规的化疗药物有阿霉素(DOX)、氨甲喋呤和顺铂等，这些药物能诱导包括骨肉瘤细胞在内的多种肿瘤细胞衰老和凋亡。衰老和凋亡是抑制肿瘤细胞增殖的重要机制。然而衰老和细胞凋亡不同，凋亡是死亡的一种方式，衰老的细胞没有死亡，只是进入了一种不同于静止期细胞的非增殖状态，衰老细胞增殖停止，但是仍然有活性[7-9]。有报道[3-5]，衰老的细胞可能被吞噬细胞清除，也可能存在很长时间。这种存活的细胞最终的命运会是什么？本实验观察到在阿霉素处理4 d后，超过90%的U2OS或MG63进入衰老状态；在撤出阿霉素后，再继续培养一段时间，细胞数目显著增加，提示有衰老细胞脱逸阿霉素诱导的衰老状态重新增殖。通过对脱逸衰老细胞集落形成能力及裸鼠成瘤能力的评估，证实脱逸衰老的细胞具有成瘤能力。

衰老细胞增殖停止，但是仍然有活性，能分泌多种可溶性因子即衰老相关的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)。EGF和IL-6等多种因子分泌增加在其他衰老细胞中也被观察到[7-9]。骨肉瘤是高表达EGFR肿瘤[10]，为SASP发挥作用，起到放大作用。EGFR/PI3K/Akt 通路可以调控SOX2表达[11]。在干细胞中SOX2 和EGFR构成一个正反馈环路。因此，衰老的肿瘤细胞脱逸衰老可能同这些分子相关，需要进一步实验证实。

本研究揭示了衰老骨肉瘤细胞能够脱逸细胞衰老重新增殖成瘤能力更强，它可能成为骨肉瘤复发的种子细胞，引起骨肉瘤复发。