miR-374促进急性心肌梗死诱导心肌纤维化的机制

王晓燕 朱磊 穆东 骆海霞 许香梅

(石家庄市第一医院心内科，河北 石家庄 050011)

急性心肌梗死(AMI)是冠状动脉不稳定的粥样硬化斑块发生破裂、出血，继发血栓形成，引起冠状动脉持续完全闭塞，使相应的心肌出现严重而持久的缺血，导致心肌坏死〔1〕。AMI后所产生的心室重构(VR)是心肌梗死向心力衰竭发展的关键过程，直接影响患者的转归。在VR的病理过程中，心肌梗死后心肌细胞的坏死和心肌间质细胞的增生导致心室的大小、形态、结构和功能状态发生较明显的变化，而随着心肌成纤维细胞(CFs)的异常大量增殖，胶原沉积的持续进行和降解的减少，从而引起心肌纤维化(MF)的发生〔2〕。进一步引起心室顺应性降低，心室舒张功能减退，诱发心力衰竭。当前研究证实，心肌梗死后所引发的一系列炎症反应及炎症因子在梗死区和非梗死区的MF中发挥了重要的作用，Ono等〔3〕发现肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和IL-6在心肌梗死后非梗死区的表达升高，并且其表达水平与心功能恶化程度和胶原沉积程度呈正相关。因此，抑制炎症因子的激活对于MF的防治，改善心脏功能具有重要意义〔4〕。研究显示，微小RNA(miR)在MF等心脏疾病的发生及发展中发挥了关键作用。研究显示，miR-22可促进MF的进程，miR-26a可通过下调结缔组织生长因子和Ⅰ型胶原(COL1)的表达从而抑制MF〔5〕。所以miR具有成为MF防治生物标志物的潜力。本研究旨在分析miR-374对心肌梗死诱导的MF所产生的影响，探讨miR-374与抗炎因子IL-10的调控关系在MF中的作用机制。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2017年10月至2018年5月在石家庄市第一医院就诊的AMI患者82例，其中男47例，女35例。选取同期50名健康体检者为健康对照组。采集研究对象肘静脉血5～6 ml；待血清析出后以1 200 r/min离心10 min，取上层血清保存至-80℃冰箱待检。

1.2构建AMI小鼠模型 雄性C57/BL6小鼠随机分为假手术组(6只)、AMI组(12只)、AMI+miR-374组(12只)。AMI组用2%水合氯醛(100 mg/kg)腹腔注射麻醉。胸骨左缘第2～4肋开胸，识别前降支走行范围，7/0滑线结扎左前降支，当结扎区域颜色转为苍白，心电图示波为心肌梗死表现时确认模型构建成功。假手术组开胸但不结扎左冠状动脉。其余步骤同AMI组。AMI+miR-374组采用miR-374 mimics慢病毒进行心肌局部注射。

1.3心脏功能检测 术后2 w，10%水合氯醛腹腔注射进行麻醉，然后心脏彩超检查并记录左室射血分数(LVEF)，左室长轴缩短分数(FS)，左室舒张末期内径(LVDd)和左室收缩末期内径(LVDs)。

1.4半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3和Caspase8活性检测 按照Caspase3和Caspase8活性检测试剂盒说明书检测。

1.5实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测 采用Trizol 法提取总RNA，实验按照Trizol试剂盒说明书操作，将消化后的组织悬液中加入氯仿，剧烈震荡15 s，室温静置20 min，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min；吸取上清，加入等体积预冷的异丙醇，混匀，室温静置20 min，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min；弃上清留沉淀，加入1 ml预冷的75%乙醇，混匀，4℃ 12 000 r/min离心5 min，弃去乙醇；沉淀物静置30 min，根据沉淀大小分另加入10～30 ml焦碳酸二乙酯(DEPC)水，充分溶解；紫外分光光度仪检测260 nm处OD值，计算RNA的浓度和纯度，-80℃冰箱保存备用。将提取到的总RNA按照反转录试剂盒的说明书进行RNA逆转录，合成cDNA。按照qRT-PCR 试剂盒说明书进行PCR。qRT-PCR用于检测假手术组和AMI组心肌组织中miR-374的表达水平及各组COL1A1和Ⅲ型胶原(COL3)A1 mRNA表达水平及转染miR-374 mimics对IL-10 mRNA表达的影响。反应为20 μl体系，各添加物为DNA 2 μl、上游引物0.4 μl、下游引物0.4 μl、2×SYBR Premix Taq TM 10 μl、Rox reference Dye Ⅰ 0.4 μl、dH2O 6.8 μl。

1.6Masson三色染色 切取心肌标本，采用固定液固定，浸蜡包埋，固定于切片机上切成3～5 μm薄片，严格按照说明书采用Masson三色染色对各组MF程度进行分析。

1.7细胞培养和转染 CFs于37℃、5% CO2培养箱中培养，1～2 d传代1次，取2～4代细胞进行实验，按照说明书分别转染miR-374 mimics和阳性对照miRNA mimics。

1.8荧光素酶报告分析 构建IL-10野生型3′-非翻译区(UTR)荧光素酶报告基因质粒pMIR-WT，并以pMIR-WT质粒为模板，利用PCR搭桥法构建其潜在结合位点荧光素酶突变型质粒(pMIR-Mut)。将miR-374 mimics，内参海肾荧光素酶及pMIR-WT和pMIR-Mut报告基因质粒共转染进CFs细胞中，在细胞培养箱中培养36 h后，用裂解缓冲液裂解细胞后分析双荧光素酶活性。

1.9Western印迹检测 采用含50 mmol/L Tris-HCl (pH7.4)，150 mmol/L NaCl，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)和蛋白酶抑制剂及1 mmol/L苯甲基磺酰氟的放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液分离蛋白质，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，AMI组和AMI+miR-374组心肌组织中IL-10、P65和P50蛋白的表达按说明书进行Western印迹检测。

1.10统计学方法 采用SPSS22.0软件进行方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1miR-374在AMI患者及AMI小鼠中的表达水平 AMI患者血清中miR-374的表达水平(1.833±0.231)显著高于健康对照组(1.000±0.211，t=20.772，P<0.001)；miR-374在AMI组小鼠心肌组织中的表达(2.632±0.311)显著高于假手术组(1.000±0.282，t=10.836，P<0.001)。

2.2miR-374与AMI小鼠心功能的相关性 AMI组LVEF和FS显著低于假手术组(P<0.01)，LVDd和LVDs显著高于假手术组(P<0.01，<0.05)；而与AMI组相比，AMI+miR-374组LVEF和FS显著降低(P<0.01)，LVDd和LVDs显著升高(P<0.01)。见表1。

2.3miR-374与AMI小鼠心肌组织中Caspase3和Caspase8活性的相关性 AMI组Caspase3和Caspase8活性显著高于假手术组(P<0.01)。与AMI组相比，AMI+miR-374组Caspase3和Caspase8活性显著升高(P<0.01)。见表1。

2.4miR-374对AMI小鼠心脏纤维化的影响 相比AMI组，AMI+miR-374组左心室纤维化程度增加(图1)；AMI+miR-374组心肌组织中COL1A1和COL3A1 mRNA表达水平(3.32±0.54,4.11±0.52)显著高于AMI组(1.52±0.23，1.85±0.20，P<0.01)。

表1 各组心功能、Caspase3和Caspase8活性、心脏纤维化比较

与假手术组比较：1)P<0.01,2)P<0.05；与AMI组比较：3)P<0.01；下表同

图1 miR-374对AMI小鼠心脏纤维化的影响(Masson三色染色,×50)

2.5miR-374对IL-10的靶向调控作用 通过microRNA靶基因数据库进行筛选，预测IL-10是miR-374的潜在靶基因(图2)。双荧光素酶检测结果显示，pMIR、pMIR-WT、pMIR-Mut各组荧光素酶活性分别为1.00±0.21、0.30±0.02、1.24±0.15，miR-374mimics可明显抑制pMIR-WT荧光素酶活性(P<0.01)，而对pMIR-Mut荧光素酶活性无明显影响(P>0.05)。qRT-PCR检测发现，相比对照组(1.00±0.15)，转染了miR-374mimics的CFs细胞中IL-10 mRNA表达水平(0.41±0.03)显著降低(P<0.01)。这些结果验证了IL-10是miR-374的靶基因，并且miR-374可抑制其表达。Western印迹结果显示，相比AMI组，AMI+miR-374组心肌组织中IL-10蛋白表达显著降低，而P65和P50蛋白磷酸化增加(图3)。

图2 利用TargetScansl预测IL-10为替在靶基因

图3 miR-374对IL-10、P-P65、P-P50的靶向调控作用

3 讨 论

MF是心肌梗死后VR的重要病理过程，主要表现为CFs的异常增殖活化和过度的胶原沉积〔6〕。MF的发展会造成心肌变硬，心肌收缩和舒张功能受损，心脏功能不全，甚至导致心力衰竭。而在这一过程中，TNF-α，IL-1，IL-6等炎症因子发挥了重要的促纤维化作用。miR是一类长度为19～25 nt的非编码单链小分子RNA，通过与靶基因的3′-UTR区域完全或不完全配对，从而在转录后抑制基因表达。miR参与调控细胞的增殖、迁移、分化和凋亡，在心血管、肿瘤等多种疾病中发挥着重要作用〔7〕。当前研究显示，部分特异性的miR与MF的发生及发展密切相关。van Rooij等〔8〕发现miR-29可通过下调胶原的合成抑制心脏MF的发展。miR-101a能抑制CFs的增殖、分化和迁移并改善心脏功能。还有报道指出，miR-1、miR-132、miR-133可抑制MF，miR-15、miR-21、miR-199可促进MF。虽然目前已报道了许多与MF有关的miR，但miR-374在AMI诱导的MF中作用尚不明确。本研究说明miR-374过表达可促进AMI小鼠心肌细胞凋亡及心脏功能的恶化。

当前研究显示，在MF过程中，COL1和COL3是心肌间质中过度沉积的主要胶原，是反映MF的一个主要指标〔9〕。本研究表示miR-374过表达可上调COL1和COL3浓度。同时miR-374在AMI小鼠MF的发展中发挥促进作用。

炎性因子的异常表达与心血管疾病的发生及发展密切相关〔10〕。心肌梗死后，随着各种炎性因子的激活，持续过度的炎症反应将造成心肌损伤，导致MF。IL-10又称细胞因子合成抑制因子，是一种炎性细胞抑制因子。IL-10具有抑制中性粒细胞和单核细胞等产生趋化因子和炎性因子的作用，抑制γ-干扰素、IL-1、IL-2、IL-8和TNF-α等炎性细胞因子的表达，激活基质金属蛋白酶(MMP)组织抑制因子(TIMP)1并抑制MMP9的合成，在免疫调节和炎症反应的多个环节中发挥抗炎作用〔11〕。有研究显示，IL-10在冠状动脉疾病中可稳定斑块，抑制斑块的形成，发挥保护作用〔12〕。Mallat等〔13〕发现IL-10缺陷的大鼠动脉粥样硬化易感性明显升高，而通过外部给予IL-10后，其动脉粥样硬化损伤区域明显降低。本研究验证了IL-10是miR-374的靶基因，表明miR-374可通过靶向调控IL-10而参与AMI诱导MF的病理过程中。

IL-10可抑制核因子激活的B细胞的κ-轻链(NF-κB)增强的表达，而NF-κB是TNF-α、IL-1β等多种炎性因子激活的共同媒介。这些激活的炎性因子又可进一步促进NF-κB的表达，导致炎性因子呈级联放大趋势不断被激活，使心肌损伤，纤维化等病变程度不断加重。NF-κB是一种多向调节功能的转录因子，其构成亚基分别是NF-κB1(p50/p105)，NF-κB2(p52/p100)，v-rel网状内皮细胞过多症病毒癌基因同源物(Rel)A(p65)，RelB和c-Rel。NF-κB是以同源或异源二聚体的形式存在，其中主要是p65/ p50异源二聚体。在静息细胞内，NF-κB二聚体在胞质中与κB抑制剂(IκB)结合形成无活性的三聚体。当细胞受到细胞因子、细菌、病毒、心肌组织的缺血性损伤和紫外线等外界刺激后，IκB蛋白磷酸化，泛素化，IκB蛋白降解后，NF-κB二聚体得以释放进而活化后，转移到细胞核中并与靶基因结合以促进靶基因的转录。NF-κB在心肌细胞、CFs和血管平滑肌细胞中均有表达，在心肌缺血再灌注损伤、MF、心肌细胞凋亡、心力衰竭等心血管疾病的病理过程中发挥重要作用〔14〕。有报道指出，NF-κB可介导血管紧张素受体阻滞剂Ⅱ，TNF-α促进CFs增殖及胶原的表达。Frantz等〔15〕发现心肌梗死后10 w的大鼠心肌细胞中，NF-κB被持续慢性激活。Ritchie〔16〕研究显示，NF-κB在急性冠脉综合征患者中被显著激活，其激活程度与冠心病严重程度密切相关。本研究表示，miR-374可通过抑制IL-10的表达促进NF-κB信号通路的激活。而NF-κB介导的炎性反应可促进MF，提示miR-374在AMI诱导的MF过程中发挥促进作用。

综上，miR-374可能通过结合IL-10的3′-UTR从而抑制IL-10表达并促进NF-κB活化。过表达miR-374可导致AMI小鼠心脏功能下降，促进小鼠在AMI后MF的发展。因此，miR-374可能为AMI诱导MF的防治提供了新的研究方向与治疗靶点。