老年H型高血压患者颈动脉内膜中层厚度与MTHFR基因多态性的关系

王静 陈劲 汤其强

(1安徽医科大学附属省立医院神经内科，安徽 合肥 230001；2合肥市第二人民医院老年科)

据统计，颈动脉粥样硬化(AS)作为一种心血管疾病其患病率持续升高〔1〕。有研究指出，血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平与心脑血管疾病密切相关，Hcy水平升高，脑卒中发病风险升高，而血浆中Hcy降低后，心脑血管疾病的发生率显著降低〔2,3〕。H型高血压即伴有高Hcy血症的原发性高血压，已知高血压和高Hcy血症可协同增加患者并发心脑血管疾病的风险〔4,5〕。颈动脉内膜中层厚度(IMT)是临床预测全身AS的主要指标，其在心脑血管事件的发生中具有很好的预测价值〔6〕。研究表明，血浆Hcy对动脉粥样硬化和血栓形成具有促进作用〔7〕。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是Hcy分解代谢的关键酶，MTHFR基因缺陷导致酶活性异常，从而影响血浆Hcy水平〔8〕。MTHFR基因中677C/T位点具有多态性，其中677CT、TT型可导致Hcy水平升高。有研究指出，MTHFR基因C677T突变和动脉粥样硬化形成有关〔9〕，但关于MTHFR基因与颈动脉内膜厚度的关系鲜有报道。本研究旨在探讨老年H型高血压患者IMT与MTHFR基因多态性的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 2016年8月至2018年12月在合肥市第二人民医院接受治疗的274例高血压患者作为高血压组，其中男182例，女92例；年龄60～80岁，平均(68.03±7.35)岁；根据血浆Hcy检测结果，将高血压组分为H型高血压组196例和非H型高血压组78例；根据超声检查结果将H型高血压组分为伴有IMT增加的H1组(88例)和无IMT增加的H2组(108例)两个亚组。另选择同期在合肥市第二人民医院体检的180位健康体检者作为对照组。对照组男118例，女62例；年龄60～78岁，平均(70.43±7.29)岁。各组年龄、性别构成比较差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：高血压患者均符合《中国高血压防治指南(2010年)》中的诊断标准〔10〕。排除标准：①患有恶性肿瘤、甲状腺疾病者、血液系统疾病；②近3个月内服用维生素B6、维生素B12、叶酸及其他影响血清Hcy水平者；③患有继发性高血压者如原发性醛固酮增多症，肾动脉狭窄，肾实质性高血压等。本研究经合肥市第二人民医院伦理委员会批准。受试者均知情同意。

1.2方法

1.2.1样本的采集 研究组入院第二日清晨采集患者静脉血6 ml分为两份，一份置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中摇匀，2 500 r/min离心5 min，分离上层血浆置于-80℃冰箱密封保存，分离中层白细胞于-80℃保存，检测MTHFR基因多态性。一份室温静置20 min，2 500 r/min离心15 min，收集上层血清置于-80℃冰箱待检。对照组于体检时采集静脉血6 ml，同上述处理方法一致分别收集血浆、血清、白细胞。

1.2.2生化指标的检测 对上述所收集血清进行三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)等生化指标的测定。所测指标均由专业检验科人员使用日本Hitch7600全自动生化分析仪检测。

1.2.3血浆Hcy水平的检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆Hcy水平，检测使用DG 3022A型酶联免疫检测仪，试剂盒购自北京九强生物技术有限公司。

1.2.4MTHFR基因多态性的检测 提取各组研究对象白细胞中的基因组DNA，采用扩增阻滞突变系统-聚合酶反应(ARMS-PCR)扩增MTHFR C677T基因片段，根据NCBI查询 MTHFR C677T的序列号设计引物，上游：5'-TGAAGAGAAGGTGTCTGCGGA-3'，下游：5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'，引物由北京阅微基因技术有限公司合成。PCR条件：94℃解链10 min；94℃变性45 s，62℃退火40 s、72℃延伸45 s，循环共计39个；72℃下延伸7 min。扩增产物经Hinf酶切，2%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，随后进行溴乙啶染色，并对DNA显色条带进行观察和分析，判断基因型。

1.2.5IMT的测定 应用美国ATL HDI-5000型彩色多普勒超声诊断仪检测颈动脉IMT，测量IMT，IMT<1.0 mm表示厚度正常，1.0 mm≤IMT<1.2 mm表示增厚，IMT≥1.2 mm表示斑块形成。

1.3统计学分析 采用SPSS23.0软件进行方差分析、采用χ2检验；采用Spearman相关性分析，对影响IMT增厚的因素进行Logistic回归分析。

2 结 果

2.1各组一般资料和生化指标的比较 H1组、H2组、非H型高血压组、对照组的年龄、性别、BMI、吸烟史均差异无统计学意义(P>0.05)；H型高血压组Hcy水平显著高于非H型高血压组和对照组(P<0.05)，H1组Hcy水平显著高于H2组(P<0.05)；H型高血压组的高Hcy血症比例显著高于对照组和非H型高血压组(P<0.05)，且H1组的高Hcy血症比例显著高于H2组(P<0.05)；H1组、H2组、非H型高血压组IMT显著高于对照组(P<0.05)，H1组、H2组IMT显著高于非H型高血压组(P<0.05)，H1组的IMT显著高于H2组(P<0.05)；H1组、H2组、非H型高血压组的TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比较无显著差异(P>0.05)，但三组TG、TC、LDL-C、HDL-C水平均显著高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 各组一般资料、生化指标的比较

与对照组相比:1)P<0.05；与非H型高血压组相比:2)P<0.05；与H2组相比:3)P<0.05，表2同

2.2基因分型检测结果 CC基因型长度为198 bp，无酶切位点；CT酶切后产生两个片段，电泳带分别为198 bp和175 bp；TT型酶切后产生2个片段，电泳带显示175 bp，2%琼脂糖凝胶电泳显影结果如图1、图2所示。

M为标记，1～12为CC基因型图1 MTHFR基因C677C PCR扩增产物

2.3各组MTHFR C677T 基因型及等位基因频率比较 四组CC、CT基因型无显著差异(P>0.05)；H1组TT基因型频率显著高于H2组、非H型高血压组和对照组(P<0.05)，其等位基因T频率也显著高于H2组、非H型高血压组和对照组(P<0.05)；H2组TT基因型频率显著高于对照组，与非H型高血压组无显著差异(P>0.05)，其等位基因T也显著高于对照组和非H型高血压组(P<0.05)。见表2。

2、3、4、5、6、9为CT型；1、7、8为TT型，M为标记图2 MTHFR基因C677T、T677T扩增产物

表2 各组MTHFR基因型及等位基因频率比较〔n(%)〕

2.4高血压组MTHFR C677T基因型的Hcy水平和IMT的比较 在H1组、H2组中，不同MTHFR C677T基因型的Hcy水平和IMT比较均有显著差异(P<0.05)，均表现为TT基因型的Hcy水平和IMT高于CT、CC基因型，CT基因型高于CC基因型；非H型高血压组TT基因型的Hcy水平和IMT显著高于CC基因型(P<0.05)，与CT基因型无显著差异(P>0.05)。见表3。

表3 各组不同基因型Hcy水平和IMT比较

与本组CC基因型相比:1)P<0.05；与本组CT基因型相比:2)P<0.05

2.5高血压组MTHFR C677T基因多态性、Hcy水平、IMT相关性分析 MTHFR C677T基因型与Hcy水平呈正相关(r=0.783，P=0.000)，调整年龄、性别、BMI、血脂等影响因素后，MTHFR C677T基因型与Hcy水平仍呈正相关(r=0.770，P=0.001)。Hcy水平与IMT呈正相关(r=0.591，P=0.006)，其中H型高血压组的相关性更高(r=0.793，P=0.000)，调整年龄、性别、BMI、血脂等影响因素后，Hcy与IMT仍存在正相关性。

2.6对影响IMT的因素进行Logistic分析 以MTHFR C677T基因型率作为自变量，以是否发生H型高血压合并颈动脉内膜增厚为因变量，结果显示TT基因型患者H型高血压合并颈动脉内膜增厚及存在AS斑块的风险是CC基因型和CT基因型的2.213倍(OR=2.213，95%CI：1.097～4.186，P=0.023)，调整年龄、性别、BMI、血脂等传统因素后，TT基因型患者H型高血压合并颈动脉内膜增厚及存在颈AS斑块的风险是CC基因型和CT基因型的2.090倍(OR=2.090，95%CI：1.072～4.101，P=0.030)。

3 讨 论

Hcy是一种含硫氨基酸的中间产物，其在体内含量微少，目前研究认为Hcy代谢关键酶MTHFR的活性降低、叶酸、维生素B6等辅酶缺乏是导致Hcy水平升高的主要因素〔11～13〕。MTHFR基因的突变可对Hcy的再甲基化途径产生影响，造成Hcy水平的升高〔14〕。研究发现，TT型酶活性在37℃时较CC型下降50%～60%，46℃时下降约65%；CT型突变酶活性也有所降低，但较TT型酶活性高〔15〕。MTHFR基因677位C突变为T可使MTHFR酶活性降低，引起Hcy再甲基化受到影响，导致血Hcy水平升高〔16〕。本研究结果提示MTHFR C677T基因型的不同与H型高血压患者血Hcy水平密切相关。

H型高血压是合并Hcy升高的高血压，其包含引发AS性心血管疾病的高血压和高Hcy两大危险因素〔17〕。另有研究报道，高血脂也与AS性心血管疾病密切相关。研究报道，高血脂患者约70%合并高尿酸血症，而高尿酸被证实是心血管疾病死亡的独立危险因素，因此积极控制高血脂水平，对心血管疾病患者具有重要意义。本研究结果提示血脂水平不随Hcy水平的变化而有显著变化。高浓度的Hcy可对血管内皮产生直接的毒性，造成血管内皮损伤，而血管内皮细胞结构和功能受损是AS形成的起始因素〔18,19〕。高Hcy水平可通过下调血管内皮细胞纤溶酶原激活剂(t-PA)mRNA表达，上调纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1 mRNA 表达，降低纤溶系统活性，造成凝血和纤溶功能紊乱，促进AS的发生和发展〔20,21〕。研究表明，高Hcy可与高血压协同促进AS斑块形成，诱发脑血栓、急性脑梗死等疾病〔22〕。另有统计数据指出IMT增加和缺血性脑卒中的发生风险呈显著正相关〔23〕。大量研究表明，颈动脉IMT具有较高的预测心血管疾病发生的价值〔24,25〕。本研究与上述研究结论一致。

有研究指出MTHFR C677T参与动脉内弹力层的断裂，促进平滑肌细胞迁移至内膜中，引发动脉粥样硬化〔26,27〕。Hou 等〔28〕研究发现，MTHFR C677T基因突变者的心血管疾病发生率较对照组升高3倍。研究报道，与正常组相比，脑卒中患者MTHFR基因纯合子和杂合子突变的发生率均显著升高，其表明MTHFR C677T基因突变可能是脑卒中的易感因素〔29,30〕。本研究提示在H型高血压患者中，MTHFR C677T基因多态性是导致患者颈AS发生发展的独立危险因素，纯合子突变者发生颈动脉IMT增厚或颈AS斑块的风险显著升高。

综上，高Hcy水平、MTHFR C677T的多态性显著增加IMT增厚及斑块形成的风险，且纯合子突变发生动脉IMT增厚的风险更高。但因为本研究样本量较小，仍需进一步扩大样本量进行深入研究。