口腔鳞状细胞癌表面增强拉曼光谱的纳米探针构建及应用研究

闫 冰 薛丽丽 关丽梅 张炳煌 骆献阳▲

1.厦门大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科，福建厦门 361003；2.厦门大学医学院，福建厦门 361003；3.厦门市耳鼻咽喉头颈外科重点实验室，福建厦门 361003；4.厦门大学附属第一医院口腔科，福建厦门 361003

口腔癌是头颈部常见恶性肿瘤，发病率逐年升高，在全身恶性肿瘤发病率排名第十二名，而在发展中国家发病率排名第八名。在我国，口腔癌发病率也呈逐年升高的趋势[1-3]。口腔癌的病理类型主要是口腔黏膜鳞状细胞癌，虽然随着科技进步，口腔癌的治疗方法及药物不断更新，但其预后依然较差，5 年存活率仅为50%～60%[3]。早期诊断、早期治疗依然是改善口腔癌患者预后的最有效方法，其中治疗方式以外科手术切除肿瘤及颈部淋巴结为主，术中手术切缘是否有肿瘤残留对患者的预后至关重要。

表面增强拉曼光谱技术（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）基于电磁场增强和电荷转移增强的拉曼光谱新技术，其原理是将纳米级探针加入在待测样本中进行混合，纳米探针在待测样本表面近距离接触时可以增强局域电磁场，提高了待测样本分子拉曼散射的概率，从而指数级地提高待测样本拉曼信号强度[4-5]。SERS 具有快速、便捷、无创检测等优势，检测灵敏度高，单个分子样本也可被检测，已广泛应用于生物医学领域的研究，如疾病检测及诊断[6]。

研究表明，口腔黏膜癌前病变时期表皮生长因子受体（epidermal growth factor recptor， EGFR）表达即开始增强，EGFR 主要在上皮细胞表达，在癌变过程中鳞状上皮细胞EGFR 表达水平不断增高[7-8]。因此，本研究构建一种EGFR 抗体修饰的纳米探针并将其应用于口腔鳞状细胞癌SERS 的检测研究中。

1 材料和方法

1.1 EGFR抗体修饰的纳米探针制备

在容量瓶中配置100mL 1.0×10-4g/mL 氯金酸水溶液，加入至250mL 圆底烧瓶中。在快速搅拌下将溶液加热至沸腾，迅速一次性加入0.95mL 1.0×10-2g/mL 的柠檬酸钠水溶液，继续搅拌沸腾30min 后冷却。然后取该溶液10mL，缓慢滴加100μL 0.1mM的4-巯基苯甲酸（4-mercaptobenzoic acid， 4-MBA）溶液并不断搅拌，充分搅拌混合30min 后静置过夜，再以6000r/min 离心10min，去除上清液，去离子水重悬即可使用。取上述10mL Au-MBA 粒子，在搅拌下缓慢滴加550μL 0.2mM的α-巯基-ω 羧基聚乙二醇（α- mercapto -ωcarboxyl polyethylene glycol， PEG）溶液，调整PEG的浓度为20μM，充分搅拌混合30min 后静置过夜后，6000r/min 离心10min，去除上清液，去离子水重悬即可使用。取上述溶液10mL，加入0.5mM 的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐[1- （3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC] 和N- 羟 基 琥 珀 酰 亚 胺（Nhydroxysuccinimide， NHS）溶液各10μL，混合搅拌30min 后离心，将剩余的EDC 和NHS 去除，加入EGFR 抗体2μL，混合搅拌30min 后保存于4℃冰箱中即可使用。生成MBA、PEG 及EGFR 抗体修饰的纳米级金颗粒。

1.2 探针性能检测

应用共聚焦显微拉曼光谱仪（Renisha 公司，英国）对不同粒子进行拉曼光谱检测。应用VancourRaman Algorithm 软件[9]去除光谱荧光信号及噪声，平滑光谱。应用Oringin 8.0（Oringin 公司，美国）软件绘制不同粒子光谱进行比较。应用S-4800 场发射扫描电子显微镜检测不同粒子形态。应用Cary5000 紫外可见近红外分光光度计（安捷伦公司，中国）检测不同粒子的吸收光谱，反应粒子表面变化，进而提示粒子表面被不同分子修饰。本研究采用流式细胞术检测EGFR 抗体修饰的纳米探针细胞毒性。取1mL 原液，3000r 离心10min 后去上清液，加入1mL 细胞培养基，超声震荡溶解，再添加9mL 培养基将纳米探针浓度调整为1nmol/L，作为检测的基准浓度分别加入到SCC-4 细胞，Tca8113细胞和成纤维细胞。应用流式细胞术对上述细胞进行检测，观察细胞凋亡情况，无纳米探针加入的细胞组作为对照组。

1.3 口腔鳞癌肿瘤组织SERS成像研究

本研究选取无免疫裸鼠皮下接种舌鳞癌细胞SCC-4、Tca8113 及纤维肉瘤细胞HT1080。每个细胞系选取8 只小鼠进行实验，SCC-4 和Tca8113 作为实验组，HT1080 作为对照组。待小鼠肿瘤直径达1cm 左右时，将浓度为1.2×10-7μmol/mL （7.3×1010个/mL）的纳米粒子混悬液200μL 多点注射至肿瘤内24h 后处死小鼠，将肿瘤完整剥离后，应用Leica切片机（Leica 公司，德国）将肿瘤组织进切片，切片厚度约10μm，连续进行组织切片，将其中一张组织切片贴附于定制铝片上，进行拉曼光谱检测，而将另外一张组织切片贴附于载玻片上并进行HE 染色。通过与HE 切片进行位置比对后，确定铝片上拉曼光谱检测部位，应用Nanophoton Raman-11（Nanophoto公司，日本）激光显微共聚焦拉曼光谱仪检测。检测条件：激发光波长785nm，线性扫描，激发功率10mW，扫描时间10s，光栅设定为600/mm，累及2 次。应用Raman imager（Nanophoto 公司，日本）软件绘制组织拉曼光谱图。

2 结果

2.1 纳米探针制备及性能检测结果

本研究中经过氧化还原方法制备的Au 纳米粒子，其浓度约10nmol/L，直径约55nm，类圆形颗粒，大小心态均一，性状稳定，可以常温下保存5 ～7d（图1）。纳米粒子及EGFR 抗体修饰后的纳米探针扫描电镜可见，单纯Au 纳米粒子容易出现团聚现象，但随着MBA、PEG 以及EGFR 抗体加入后，修饰纳米粒子表面，其团聚现象得到改善。同时在纳米Au 粒子表面形成一层高分子修饰膜，表明MBA、PEG 以及EGFR 抗体成功修饰Au 粒子表面（图1）。

图1 纳米Au 粒子及MBA、PEG 及EGFR抗体修饰的纳米探针的扫面电镜

本研究中，采用EDC 和NHS 活化PEG 的羧基端使其更好地与EGFR 抗体的氨基端相结合。不同粒子的紫外可见光吸收光谱同样提示通过不同分子修饰后粒子表面性状改变（图2）。对不同粒子进行拉曼光谱检测，结果提示单纯Au 粒子无拉曼活性，但经过MBA 拉曼活性分子修饰后，可见明显的拉曼信号1073/cm 和1589/cm。而后经过PEG修饰后，拉曼信号无明显变化，表明PEG 无明显拉曼活性，不会影响MBA 拉曼信号。最后在粒子表面加入EGFR 抗体修饰，经过修饰后，可见其拉曼光谱中主要拉曼信号仍为1073/cm 和1589/cm，但可见1004/cm 和1543/cm，表面纳米粒子表面存在蛋白质类生物分子结构，这也从光谱检测方面验证了EGFR 抗体已修饰在Au 粒子表面（图2）。同时，流式细胞仪检测结果，经过MBA、PEG 及EGFR 抗体修饰的纳米探针对细胞凋亡率也无显著影响，见图3 及表1。流式细胞仪结果提示实验组和对照组细胞细胞周期无明显差异，表明纳米探针对细胞无明显毒性。

图2 纳米Au 粒子及MBA、PEG、EGFR 抗体修饰纳米粒子表面不同阶段的拉曼光谱及吸收光谱

图3 不同组细胞流式细胞检测细胞凋亡结果

表1 三种细胞经过纳米探针处理24h后的细胞凋亡比例（%）

2.2 纳米探针应用于口腔鳞状细胞癌组织的SERS成像研究

HE 切片采用多个部位连续切片进行观察。完成封片后进行镜检拍照，可见石蜡切片HE 染色的部分切片组织细胞核空洞，各组间未发现明显差异，但Tca8113、SCC-4 组织内可见局部纳米粒子聚集，而HT1080 肿瘤组织内未见明显纳米粒子聚集。Tca8113、SCC-4 鳞状细胞癌肿瘤细胞EGFR高表达，而HT1080 为人成纤维肉瘤细胞，EGFR 表达较低，因此该结果提示经过修饰后的纳米粒子对EGFR 高表达的肿瘤组织具有一定的特异性，倾向聚集于肿瘤细胞EGFR 高表达的肿瘤组织，而肉瘤细胞HT1080 肿瘤组织内无明显纳米粒子聚集（图4）。应用Nanophoton Raman-11 激光显微共聚焦拉曼光谱仪检测对SCC-4、Tca8113 及HT1080 肿瘤组织进行拉曼光谱检测，以纳米探针上MBA 拉曼活性信号1073/cm 作为特征谱峰，绘制肿瘤组织的拉曼光谱图像。如图5 所示，鳞状细胞癌肿瘤组织内可见增强拉曼光谱信号1073/cm（图中白色亮点），而肉瘤肿瘤组织内未见明显增强拉曼信号。这表明合成纳米粒子具有一定的选择性，可以用于鳞状细胞癌的表面增强拉曼光谱检测研究。该结果提示经过MBA-PEG-EGFR 抗体修饰的纳米级金颗粒可以用于EGFR 高表达的肿瘤组织筛查，为临床上检测EGFR 高表达的鳞状细胞癌肿瘤组织提供了理论依据。

图4 小鼠成瘤组织HE 切片

图5 小鼠成瘤组织的拉曼光谱图像

3 讨论

随着激光技术及仪器的发展，光谱技术在恶性肿瘤的诊断及检测被广泛应用，如红外光谱检测、组织荧光检测、拉曼光谱检测等技术，这些技术的应用为恶性肿瘤的诊断提供了一种实时、便捷、准确、无创的新方法[10]。在众多的光谱诊断技术中，拉曼光谱技术成为近年来在生物医学领域研究的热点技术，其原理是分子振动引起入射光与散射光频率的差异来反映样本分子结构及组成等信息，灵敏性高，特异性强，检测样本无需处理、普适性好、操作便捷等优点，在生物医学研究领域被广泛应用[11-14]。在检测生物样本的研究中，拉曼光谱技术具有独特优势，谱峰分辨率高，可以检测液体样本、快速成像等，适用于临床疾病组织样本研究[15]。拉曼光谱对样本条件要求较低，无需预处理，同时光谱信息丰富，可获得样本内细胞、组织或体液分子结构和物质组成的信息，可以检测磷脂、DNA、多肽等物质成分组成及分子结构信息，有“分子指纹”技术之称[15-16]。基于拉曼光谱的上述优点，拉曼光谱技术被应用于检测口腔癌的研究，获得良好的结果，平均诊断准确率高达90%以上[17-18]。

本研究在应用SERS 检测技术中引入拉曼活性分子MBA、高分子PEG 及EGFR 抗体来修饰纳米粒子表面。应用生物亲和性高分子PEG 修饰纳米级探针，其巯基可以与纳米探针表层结合，为纳米提供了良好的空间稳定性，同时羧基为EGFR 抗体标记提供了良好的位点[19-20]。此外，在纳米粒子表面引入拉曼活性分子MBA 作为示踪剂用于标记纳米探针，从而制备出一种能准确检测舌鳞状细胞癌分子边界的特异性SERE 探针。PEG 作为修饰探针表层的高分子，其长链结构既可以为探针提供良好的空间稳定性及生物亲和性能，长链结构的空间位阻又可以保护作为拉曼示踪标记的MBA。PEG上的羧基经过活化剂活化后与EGFR 抗体表面的氨基相结合，从而使纳米探针具备检测肿瘤组织中EGFR 表达的特异性探针[21]。

EGFR 是一种酪氨酸激酶型跨膜受体，通过与配体结合导致EGFR 之间二聚化，激活细胞内酪氨酸激酶功能域，启动下游细胞信号通路，从而抑制细胞凋亡，有助于细胞增殖和促进血管新生，与恶性肿瘤细胞转移功能有关[22-25]。有研究显示，在无糜烂性和溃疡性病变的口腔扁平苔藓标本中，EGFR 表达较弱，而在糜烂性和溃疡性病变的扁平苔藓标本、鳞状细胞乳头状瘤标本及鳞状细胞癌标本中EGFR 的阳性率分别为20%、25%和60%，表明EGFR 在从扁平苔藓到口腔鳞状细胞癌的恶性转化过程中表达不断增加。Khan 等[24]对97 例口腔鳞癌组织标本进行研究发现EGFR 蛋白表达高达92.8%。Huang 等[25]在对194 例口腔鳞状细胞癌肿瘤标本进行研究发现，EGFR 过表达的患者预后较差，主要体现为较短的无瘤生存期，这与肿瘤细胞淋巴结转移相关，因此EGFR 过表达可以作为口腔鳞状细胞癌患者的预后评估生物标志物。因此，本研究通过构建检测口腔鳞状细胞癌组织内EGFR 的特异性纳米探针，应用SERS 技术检测检测出鳞状细胞癌组织内EGFR 表达情况，绘制出肿瘤组织EGFR 表达的拉曼图像，为临床提供一种快速、便捷、准确、可视化的肿瘤组织EGFR 表达的检测新方法，为临床上应用拉曼光谱技术检测口腔鳞状细胞癌手术切缘EGFR 的表达情况、评估患者预后、早期诊断口腔鳞状细胞癌等提供理论基础和实验技术支持，进一步促进口腔癌早期诊断、术中检测及预后评估等技术的发展，提高口腔癌患者生活质量及预后。