4种多环芳烃对虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)幼体的急性毒性研究

刘帅，刘欢，魏海峰,*，赵肖依，宋雪

1. 辽宁省近岸海洋环境科学与技术重点实验室，大连 116023 2. 大连海洋大学海洋科技与环境学院，大连 116023 3. 大连海洋大学，农业农村部北方海水增养殖重点实验室，大连 116023

多环芳烃(PAHs)是石油等产品的主要组成成分，近期，受工业活动的影响，海洋生态系统中PAHs的含量显著升高[1]。海洋溢油、工业废水排放等，使多种PAHs侵入海洋环境，破坏海洋生态系统的平衡。石油毒性主要来源于其中的PAHs组分，PAHs约占石油组分的1%～6%，PAHs类污染物分布面积广、致癌性作用强、数量多、与人类生命活动密切相关，是典型的“三致”物质，其主要来源于有机物的热解和不完全燃烧，具有残留期长、高毒性和生物富集等特点，因此，研究PAHs类污染物的毒性具有重要的意义[2]。目前，大部分国家已将PAHs作为优先控制的水环境污染物种类之一[3]。研究初期，学者大多研究水、大气、土壤和沉积物中的PAHs[4]，也有研究海洋水生动植物体内PAHs的含量[5-6]。国内外关于PAHs对虾夷扇贝幼体毒性的研究缺乏，因此，需对其毒性机理进行深入研究。

虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)是我国主要的海水养殖贝类，其肉质鲜美、营养价值和市场价值较高[7]。目前，关于虾夷扇贝的研究集中以下方面：在铜胁迫对虾夷扇贝鳃组织基因表达的影响[8]，PAHs对虾夷扇贝幼贝血清酶活性的影响[9]，亚硝酸态氮对虾夷扇贝早期生理指标的影响[10]，6种苯系物对虾夷扇贝的生殖毒性的影响[11]，以及虾夷扇贝对铅和镉的生物富集与释放规律和镉、铜胁迫虾夷扇贝的毒性作用机制等[12-13]。鉴于PAHs对虾夷扇贝的毒性研究报道较少，本文进行了PAHs对虾夷扇贝幼体的急性毒性研究，对保护海洋生物生态环境和提高虾夷扇贝存活率具有重要意义。以虾夷扇贝为研究对象，进行半静水式急性毒性实验，对暴露于不同浓度的苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯后在1 h和4 h时观察虾夷扇贝卵子受精率的差异，获得各污染下虾夷扇贝幼体的半致死浓度、安全浓度，为评估PAHs对海洋生物安全的风险提供基本理论和科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

实验所需已促熟的雌雄种贝购自獐子岛渔业集团大连旅顺养殖场，挑选健康的个体，在农村农业部北方海水增养殖重点实验室海水养殖循环系统中暂养。实验海水为大连砂滤海水，24 h持续充气。其实验用水温度保持在20 ℃左右，盐度30～31，pH 7.9，溶解氧保持在6 mg·L-1以上。种贝经过促熟后获得的性腺饱满个体的精子和卵子用于实验中。

苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯，纯度>95%，购自美国Sigma公司；丙酮，纯度为99.5%，购自上海国药集团化学试剂有限公司；过氧化氢和三羟甲基氨基甲烷，纯度分别为30%和99%，均购自天津金汇太亚化学试剂有限公司。

先将苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯用丙酮溶液分别配成500 mg·L-1的4种储备液，用这4种储备液和海水配制实验所需的不同浓度PAHs溶液。

1.2 实验方法

1.2.1 4种PAHs对虾夷扇贝受精率的影响

在1 L玻璃烧杯中完成4种PAHs对虾夷扇贝受精率影响的实验，结合预实验结果，确定苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯的处理组为1、5、10和50 μg·L-1，并设置空白对照组和体积分数为1‰的丙酮助溶剂对照组，对照组和处理组均设置3个平行样。设置实验组溶液为500 mL，加入一定体积的虾夷扇贝精子和卵子，使精子密度约为每毫升60万个，卵子的密度约为每毫升60个。搅拌均匀后，分别在1 h和4 h镜检统计受精率。为了方便观察，用卵裂卵数与总卵数的比值反映受精率。

1.2.2 4种PAHs对虾夷扇贝幼体的毒性作用

实验水体条件与培养条件一致，S3期虾夷扇贝D型幼虫采用无光培养。4种PAHs的浓度设置同1.2.1。实验进行3 d，1～3 d中每天15:00对各实验组进行检查，并记录各处理组中虾夷扇贝D型幼虫的死亡数，死亡判断标准为，通过显微镜观察到幼体心跳停止[14]。并计算幼体的死亡率及半致死浓度(LC50)。每天清除死亡幼体，避免对水质造成影响。

1.3 PAHs的LogP值与PAHs毒性关系研究

定量结构-活性相关性(quantitative structure activity relationship, QSAR)模型是预测化合物毒性的高效模型，借助正辛醇/水分配系数(LogP)与致死率关系的QSAR模型预测PAHs毒性大小。

根据公式：Kow=co/cw，LogP=Log(co/cw)

得到LogP=LogKow

式中：co为物质在辛醇中的浓度；cw为物质在水相中的浓度。

LogP是辛醇/水分配系数，代表着某一化合物的亲脂程度。4种PAHs的LogP值如表1所示。

表1 4种多环芳烃(PAHs)的结构参数Table 1 Structural parameters of four polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)

1.4 数据统计与分析

实验数据用Excel 2012软件处理，分别计算出毒理学参数，包括死亡率、半致死浓度(LC50)与4种PAHs浓度对数相关方程。安全浓度(SC)由24 h和48 h的半致死浓度求出[15]。

安全浓度(SC)=48 h-LC50×0.3/(24 h-LC50/48 h-LC50)2

利用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行统计学分析，并利用单因素方差分析法进行差异分析，分析各处理组和对照组之间的差异，P<0.05表示差异显著。

2 结果(Results)

2.1 PAHs对虾夷扇贝受精的影响

苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯对虾夷扇贝卵子受精率的影响结果如图1～图4所示。由图1可知，随着苯并[a]芘浓度的增加，虾夷扇贝1 h和4 h的受精率都呈现了较明显的下降趋势。与对照组相比，1 h时，1、5、10和50 μg·L-1的苯并[a]芘处理组的虾夷扇贝受精率分别下降了16.56%、18.95%、20.39%和20.71%；4 h时，1、5、10和50 μg·L-1的苯并[a]芘处理组的虾夷扇贝受精率分别下降了10.59%、10.72%、37.50%和42.66%。1 h和4 h时苯并[a]芘浓度与受精率之间存在线性相关关系，相关方程分别为y= -2.4117x+ 51.599，R2= 0.7816和y= -5.9594x+ 74.035，R2= 0.8736。

由图2可知，随着二甲基蒽浓度的增加，虾夷扇贝1 h和4 h的受精率都呈现了明显的下降趋势。与对照组相比，1 h时，1、5、10和50 μg·L-1的二甲基蒽处理组的虾夷扇贝受精率分别下降了6.79%、12.62%、21.46%和32.73%；4 h时，1、5、10和50 μg·L-1的二甲基蒽处理组的虾夷扇贝受精率分别下降了3.84%、12.95%、30.31%和43.75%。1 h和4 h二甲基蒽浓度与受精率之间存在线性相关关系，相关方程分别为y= -3.3529x+ 55.140，R2= 0.9307和y= -5.7154x+ 74.091，R2= 0.8832。

由图3可知，随着三甲基菲浓度的增加，虾夷扇贝1 h和4 h的受精率都呈现了较明显的下降趋势。与对照组相比，1 h时，1、5、10和50 μg·L-1的三甲基菲处理组的虾夷扇贝受精率分别下降了16.56%、20.39%、20.71%和20.97%；4 h时，1、5、10和50 μg·L-1的三甲基菲处理组的虾夷扇贝受精率分别下降了34.38%、39.22%、39.69%和45.63%。1 h和4 h三甲基菲浓度与受精率之间存在线性相关关系，相关方程分别为y= -2.4643x+ 51.617，R2= 0.7736和y=-6.2203x+ 68.433，R2= 0.8323。

图1 不同浓度苯并[a]芘作用下虾夷扇贝的受精率注：标有不同小写字母者表示显著性差异(P<0.05)，标有相同小写字母者表示无显著性差异(P>0.05)；下同。Fig. 1 Fertilization rate of Patinopecten yessoensis under the treatment of benzo[a]pyrene at different concentrationsNote: The different letters indicate significant differences at the 0.05 probability level, and the same letters indicate no significant differences; the same below.

图2 不同浓度二甲基蒽作用下虾夷扇贝的受精率Fig. 2 Fertilization rate of Patinopecten yessoensis under the treatment of 9,10-dimethylanthracene at different concentrations

图3 不同浓度三甲基菲作用下虾夷扇贝的受精率Fig. 3 Fertilization rate of Patinopecten yessoensis under the treatment of 1, 9, 10-trimethylphenanthrene at different concentrations

图4 不同浓度惹烯作用下虾夷扇贝的受精率Fig. 4 Fertilization rate of Patinopecten yessoensis under the treatment of retene at different concentrations

由图4可知，随着惹烯浓度的增加，虾夷扇贝1 h和4 h的受精率都呈现了较明显的下降趋势。与对照组相比，1 h时，1、5、10和50 μg·L-1的惹烯处理组的虾夷扇贝受精率分别下降了8.81%、18.95%、21.78%和25.43%；4 h时，1、5、10和50 μg·L-1的惹烯处理组的虾夷扇贝受精率分别下降了38.53%、51.52%、54.05%和58.33%。1 h和4 h惹烯浓度与受精率之间存在线性相关关系，相关方程分别为y= -2.7414x+ 52.553，R2= 0.9663和y= -5.9594x+ 74.035，R2= 0.8736。

实验中，丙酮对照组与空白对照组的受精率无显著差异(P<0.05)，表明丙酮助溶剂对照组可代替空白对照组。苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯高浓度处理组对虾夷扇贝卵子的受精有显著抑制作用，浓度越高抑制作用越显著，呈明显的剂量-效应关系。经过比较发现，这4种多环芳烃对虾夷扇贝的抑制率大小关系为：惹烯>三甲基菲>二甲基蒽>苯并[a]芘。

2.2 PAHs对虾夷扇贝幼体的半致死浓度(LC50)和安全浓度(SC)

4种PAHs对虾夷扇贝幼体在9、24和48 h的LC50及SC结果如表2所示。虾夷扇贝幼体在4种PAHs中暴露9、24和48 h时的LC50随时间的增加呈现下降的趋势。由于PAHs污染物毒性具有一定的累积性，暴露时间越长，导致生物的死亡率越高。苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯对虾夷扇贝幼体48 h-LC50分别为48.13、68.42、92.40和63.97 mg·L-1，故PAHs对虾夷扇贝幼体毒性大小排序为苯并[a]芘>惹烯>二甲基蒽>三甲基菲。4种PAHs对虾夷扇贝幼体安全浓度顺序为惹烯(4.68 mg·L-1)>三甲基菲(2.8 mg·L-1)>苯并[a]芘(2.49 mg·L-1)>二甲基蒽(2.25 mg·L-1)。

3 讨论(Discussion)

生态系统中的PAHs会对海洋生物产生一定的毒害作用，被我国确定为需要优先控制的环境污染物[16-18]。1986年，我国原环境保护局在《生物技术检测规范(水环境部分)》分类标准中规定，LC50≤0.1 mg·L-1，为剧毒；0.1 mg·L-1﹤LC50≤1.0 mg·L-1，为高毒；1.0 mg·L-1﹤LC50≤10.0 mg·L-1，为中毒；LC50>10.0 mg·L-1，为低毒。本实验中，苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯的毒性程度均属于低毒，它们对虾夷扇贝毒性大小排序为：苯并[a]芘>惹烯>二甲基蒽>三甲基菲。

亲代虾夷扇贝暴露于PAHs下，其卵子的受精能力会发生改变，且亲本繁殖能力也显著降低，在压力环境下虾夷扇贝性腺内性细胞的再吸收作用可以使虾夷扇贝将更多的能量分配到细胞解毒和保护过程中，导致虾夷扇贝产卵量和排精量较正常情况有所降低，因此，可以推测亲本产卵量和排精量与PAHs浓度具有一定的关系[19]。而且PAHs释放的毒性会对亲本造成伤害，亲本的遗传毒性会随虾夷扇贝配子传递给子代，影响子代的胚胎发育[19]。本实验结果表明，随着苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯处理组浓度逐渐增加，虾夷扇贝卵子的受精率呈现下降的趋势，幼体死亡率呈现上升的趋势。相同暴露时间，处理组浓度越高，则对虾夷扇贝发育影响越大，存在明显的剂量-效应关系。这表明，PAHs影响了虾夷扇贝卵子的受精能力，这可能与压力环境下虾夷扇贝卵子受精能力较正常情况有所降低有关。在苯并[a]芘和二甲基蒽对皱纹盘鲍(Haliotisdiscushannai)早期发育的毒性研究中[20]，随着苯并[a]芘和二甲基蒽浓度的增加，皱纹盘鲍卵子受精率降低，胚胎发育时间和胚胎死亡率明显增加，研究结果与本文表现出相似的规律。本实验中，4 h对照组虾夷扇贝卵子的受精率高于1 h对照组，是由于累计受精率增加，但4 h PAHs处理组虾夷扇贝卵子的受精率出现高于或低于1 h对照组的情况，这与累计受精率受到不同浓度PAHs的抑制作用有关。

相关研究显示，海洋生物对外界污染物毒性较为敏感的时期是胚胎和幼体时期，因此，研究胚胎和幼体毒性阈值可以反映海洋污染状况，而虾夷扇贝D型幼虫对毒性作用具有较高的敏感性，故选取虾夷扇贝D型幼虫为实验对象[21]。在4种PAHs的暴露下，虾夷扇贝D型幼虫存活率随PAHs浓度的升高显著降低，这表明，高浓度PAHs对虾夷扇贝D型幼虫危害较高，呈现显著的剂量-效应关系。研究表明，PAHs对海洋生物胚胎和幼体产生不同程度的影响，从而影响海洋生物生命活动[22]：4种PAHs会使仿刺参(Apostichopusjaponicus)相关组织损伤，导致有机体死亡[23]；二甲苯降低斑马鱼(Brachydaniorerio)胚胎的孵化率，导致胚胎幼体死亡或幼鱼发育畸形[24]。由此可以推测，亲本的遗传毒性会随虾夷扇贝配子传递给子代，影响子代的胚胎发育，在环境压力的胁迫下亲本的DNA受到损伤，也会引起子代畸形率增加[25]。本实验中，高浓度PAHs导致虾夷扇贝幼体死亡，可能与PAHs对虾夷扇贝幼体有毒性损伤作用以及PAHs提高了虾夷扇贝的死亡率有关。

表2 4种PAHs对虾夷扇贝幼体的毒性回归方程、半致死浓度和安全浓度Table 2 Regression equation, median lethal concentration and safe concentration of four PAHs on larva of Patinopecten yessoensis

QSAR模型是预测化合物毒性的高效模型，它可被用于预测持久性有机物(POPs)的芳烃受体配合能力，也可用于预测PAHs毒性[26-27]。辛醇/水分配系数(LogP)的值越大，可能对生物体伤害越大[28]。苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯LogP值分别为5.97、5.69、4.57和5.42。故推测其毒性大小排序为：苯并[a]芘>二甲基蒽>惹烯>三甲基菲。本实验虾夷扇贝幼体在暴露于苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯后，随暴露时间的延长和PAHs浓度的提高，受精率逐渐降低，幼体死亡率显著增加，呈现显著的剂量-效应关系。但利用QSAR模型[26]分析PAHs对虾夷扇贝幼体的致死毒性的结果与实验结果不完全一致，这可能与虾夷扇贝幼体细胞特殊的物质性质密切相关，也可能与PAHs对海洋生物作用机理不同密切相关，需要进一步深入研究。