MicroRNA保护线粒体功能延缓急性肾损伤的研究进展

曾雅妮 综述 成梅初 审校

急性肾损伤(AKI)是重症患者的常见并发症，可导致患者死亡率和慢性肾脏病(CKD)的发生率增加。AKI可伴有细胞线粒体功能紊乱伴随缺血缺氧，也是CKD的常见的原因之一，目前尚缺乏有效的治疗方法来阻止CKD的进展。近年来有研究发现大量的特异性microRNA(miRNA)参与AKI的发病机制[1]。已有研究描述了不同AKI模型中线粒体损伤在肾脏疾病发展和进展中的致病作用[2-3]。本文拟对miRNA与AKI的发病和治疗等关系进行综述，重点探讨miRNA在肾损伤中调节线粒体功能的可能机制，并讨论其在AKI治疗中的潜力。

miRNA参与线粒体活性氧(ROS)的产生与自噬

在肾缺血再灌注损伤(IRI)过程中，ROS的过量产生主要发生在再灌注早期，并在此后持续24 h，研究证明，肾近端小管细胞对缺血再灌注诱导的过量ROS引起的氧化应激特别敏感，过量的ROS会损害线粒体，引发炎症和凋亡，而线粒体又是细胞中ROS的主要来源[4]。Bai等[5]发现miR-335和miR-34a的过表达可通过抑制线粒中的超氧化物歧化酶2(SOD2)和硫氧还蛋白还原酶2(Txnrd2)诱导系膜细胞提前衰老，同时伴随着ROS的增加，在该研究中，衰老肾脏固有细胞中上调的miRNA主要调控与能量代谢、细胞增殖、抗氧化防御和细胞外基质降解相关的途径或基因，而下调的miRNA主要针对与免疫炎症反应和细胞周期停滞相关的途径或基因。在这一层面对于指导研究者对miRNA的表达谱进行筛选时有一定的意义。生理条件下，抗氧化基因产物在ROS的解毒中起主要作用。Cao等[6]发现miRNA200a-3p可激活肾小管细胞(TECs)中线粒体自身的抗氧化Keap1-Nrf2信号通路，减少ROS的产生防止线粒体碎裂。事实上，单个miRNA可以多个mRNAs为靶标，如 miR4270参与调节PI3K/AKT/mTOR、NOX5等表达，PI3K/AKT/mTOR与线粒体自噬有关[7]，NOX5是一种NAPH氧化酶，它的独特功能与产生大量ROS有关[8]。而miR-145可通过调节LC3和Beclin 1及p62这三种自噬相关蛋白，从而抑制PI3K/AKT/mTOR的磷酸化，增加LC3B染色阳性和自噬体数量来达到保护肾脏细胞的目的[9]。LC3蛋白位于自噬体前体膜表面，有A和B两种类型，当自噬小体形成时，LC3A转变为LC3B，LC3B通过与自噬小体表膜结合参与自噬溶酶体的形成。因此，LC3B染色阳性增加被认为是自噬增强[10]。

线粒体生物发生及代谢解偶联

线粒体生物发生是增加细胞中线粒体质量的过程[11]，包括两种形式,第一种是裂变和融合形成新的线粒体，第二种是先前存在的线粒体的合成。后者主要在转录水平上被调节,需要包括过氧化物酶体增殖物激活受体r共激活因子1α(PGC-1α)、线粒体转录因子A(TFAM)和核呼吸因子(NRF)在内的主要调节因子的协同表达。在脓毒症性AKI患者研究中，miR-142-5p，miR-191-5p，miR-3165，miR-4270和miR-23a-3p均与PGC-1α基因表达下调有关[12]，而PGC-1α的主要作用之一是激活线粒体生物发生和氧化磷酸化[13]。miR-23a-3p，miR-22-3p，miR-4456均参与调控PGC-1α上游基因sirt1的表达，sirt1作为线粒体动力学的关键调节因子,是一种位于线粒体基质中激活PGC-1α的主要脱乙酰化酶[14]。线粒体是一种动态的细胞器，通过分裂和融合来维持其活性和功能，有研究表明miR-30抑制动态相关蛋白1(drp1)可以预防AKI[15]，敲除肾小管上皮细胞中的线粒体内膜蛋白18(MTP18)能促进AKI的恢复和减轻纤维化[16]，这表明线粒体动力学的控制可能是一个潜在的治疗靶点。线粒体动力学异常导致的线粒体断裂是AKI及CKD(如糖尿病肾病)的重要原因之一[17]。Yu等[18]发现无论是体内或体外的肾缺血模型都可诱导miRNA-214的表达，能抑制肾小管细胞表达丝裂霉素2(Mfn2，一种关键的线粒体融合蛋白)，而用miRNA-214抑制剂可以阻止肾小管近端细胞ATP耗竭后Mfn2的下调,改善线粒体断裂和凋亡。在缺血再灌注损伤中，缺氧诱导miRNA-668表达上调，它通过抑制MTP18以维持线粒体动力学和肾小管细胞的活力，并且miR-668的上调是肾小管上皮细胞在早期和亚急性阶段的一种保护性反应，这表示线粒体断裂的抑制是一个早期事件，发生在再灌注15 min，并在亚急性损伤阶段(12～24h)仍可检测到且能持续到一定水平[19]。因此，miR-668是否可以进一步促进AKI的恢复和改善后续的纤维化值得深入研究。有研究者在顺铂诱导的AKI小鼠模型和人AKI肾组织的活检样本中检测到近肾小管细胞(PTCs)中miR-709显著上调,而线粒体转录因子(TFAM)的基因修复可减轻顺铂或miR-709过表达所致的线粒体功能障碍和细胞损伤[20]，可见调节肾脏固有细胞中的TFAM可能成为抗miR-709诱导肾脏修复的机制，且这种干预不仅可增强线粒体生物发生，还可以减轻巨噬细胞诱导的炎症、改善肾功能障碍程度、肾小管细胞坏死和凋亡。

解偶联蛋白(UCPs)是线粒体内膜上表达的一类线粒体阴离子载体蛋白，它将质子从内膜转运到基质中，从而导致内膜电位的降低，减少电子传递链上的ROS释放。当发生AKI时，线粒体内膜通透性改变，膜电位完全丧失，导致ROS的爆发。有研究者通过筛查全基因表达谱的方法确定了UCP1在肾小管中广泛表达，是参与ROS的产生及细胞凋亡的调节因子，且它的转录也受PGC-1α的调控[21]。Leijiang等[22]发现单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠模型的肾小管上皮细胞中线粒体解偶联蛋白2(UCP2)的过度表达可导致肾纤维化，而miR-30E可直接靶向UCP2 mRNA促进巨噬细胞浸润，肾小管细胞外基质的产生和肾脏纤维化，Klinkhammer等[23]发现的潜在抗纤维化治疗靶点转化生长因子β1(TGF-β1)诱导上皮-间充质转化和肾脏纤维化机制中也证实了miR-30E/UCP2轴具有重要作用(表1)。

表1 MicroRNA(miRNA)在急性肾损伤线粒体功能调节中的靶基因和作用

SOD:超氧化物歧化酶2；Txnrd：硫氧还蛋白还原酶；GPx：谷胱甘肽过氧化物酶；Catalase：过氧化氢酶；Keap1-Nrf2：Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1-核因子E2相关因子蛋白2信号通路；PGC-1α：过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α ；Sirt1：蛋白去乙酰激酶活性转录因子； VEGFA：血管内皮生长因子A ；NOX5：尼科酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶5；WNT1：WNT 1蛋白；LC3Ⅱ：微管相关蛋白1轻链3；Beclin1：自噬Beclin 1蛋白；Mfn2：丝裂霉素2；MTP18：线粒体内膜蛋白18 ；TFAM：线粒体转录因子；TGF-β1：转化生长因子β1 ；UCP2：线粒体解偶联蛋白2 ；Drp1：动态相关蛋白1

线粒体功能紊乱与AKI

引起肾脏疾病的触发因素很多，主要包括糖尿病、 高血压、 缺血性损伤、外源性有毒物质、免疫复合物沉积、感染以及遗传等。肾脏可通过适应性修复和再生恢复其结构和功能，但AKI患者的肾小管、血管、肾间质的不完全性修复会加速肾脏的纤维化，从而导致CKD。AKI主要病理表型是肾小管损伤，线粒体作为具有各种重要功能的复杂细胞内细胞器，TECs由于其重吸收功能而密集了大量线粒体，近端小管细胞中线粒体密度达29.2%[24]，这需要很高的能量消耗，而AKI时处于肾小管ATP耗竭状态[25]，因此，TECs中的线粒体功能障碍被认为是AKI-CKD转变的一种致病机制。同时，线粒体还具有一系列其他重要的功能，包括大分子的生物合成和细胞内Ca2+信号的调节。此外，它们可能是肾小管细胞ROS产生的主要来源，也在激活细胞死亡途径(凋亡和坏死)中起关键作用。肾损伤可能以不同的方式改变线粒体的结构和功能，同样线粒体动态平衡的改变反过来促进肾脏损伤，引发有害的反馈循环导致CKD的发生[26]。肾脏中的ATP来源主要是通过FAO(线粒体脂肪酸β氧化)，线粒体功能障碍会导致ATP耗竭和脂毒性，从而引发肾小管损伤、炎症和随后的纤维化，最终进展为CKD[27]。有研究表明在AKI的状态下线粒体DNA(MtDNA)的释放诱导了免疫反应和肾损伤进展，且在CKD患者的肾脏和小鼠肾纤维化模型中均发现TFAM显著降低。TFAM是一种与MtDNA结合的必需蛋白，但其在AKI向CKD转变中的作用机制尚不清楚[28]。Chung等[29]特异性地将小鼠的小管TFAM基因敲除后发现肾小管不仅出现严重的线粒体丢失，而且渗入胞质的MtDNA作为激活环磷酸腺苷合成酶(CGAS)-干扰素基因刺激物(STINDNA)信号的关键机制，会促进巨噬细胞浸润和肾脏纤维化。

miRNA调节线粒体功能保护肾脏机制

从机制上看，大多数研究将miRNA保护肾脏线粒体主要归因于阻止靶基因mRNA的翻译或诱导降解来调节基因表达，从而阻止缺血缺氧诱导的钙超载、ROS的产生，线粒体动力学破坏及代谢解偶联等一系列连锁反应[30]，这一系列反应在肾脏缺血期间启动，并且在再灌注后加剧累积[31]。调控细胞凋亡是肾脏自我保护的重要机制之一。最近的研究进展逐渐揭示了参与抗凋亡作用的特异miRNA及其靶点和信号通路(表1)，包括前文提到的Mfn2、MTP18等信号通路。自噬是miRNA参与肾脏保护的另一机制。在顺铂诱导的AKI模型中间充质干细胞(MSCs)在体内和体外均能增加自噬标志物和LC3II的表达，并与调节自噬相关基因(ATG-16L)表达有关[32]。另一组研究也表明，miRNA通过抑制mTOR信号通路增加了正常大鼠肾脏-52E(NRK-52E)细胞LC3B的表达以及ATG-5和ATG-7基因的表达[33]。前文也提到了针对PI3K/AKT/mTOR信号通路的miR-145增强了HK-2细胞LC3II和Beclin 1的表达。因此，在病理条件下，自噬作为细胞生存的适应性和保护性机制也是肾脏保护的重要机制。其他机制还包括影响线粒体的生物发生。Drp1被认为是线粒体分裂的关键调节因子，上文提到了抑制Drp1表达的miR-30可以保护线粒体功能以及通过miRNA-214抑制剂阻止Mfn2下调能起到保护肾脏的作用。通过miRNA改善氧化应激也是延缓肾脏AKI进展的一个重要机制。氧化应激主要通过ROS的产生诱导AKI细胞凋亡、坏死和炎症。在糖尿病肾病中，NADPH氧化酶(NOX5)作为ROS产生的诱导剂，随着miR-485的治疗而下降[34]。而miR-195-5p可能通过靶向血管内皮生长因子A(VEGFA)抑制氧化应激及下调炎症因子的表达来缓解AKI[35]。由此可见，miRNA通过各个方面参与了肾脏保护的调节机制,肾纤维化是CKD的病理过程，与肾功能障碍的进展密切相关。但开发miRNA疗法目前最大挑战之一是为每种疾病确定最佳的miRNA或miRNA靶点，当然其他挑战包括设计miRNA递送载体，使候选治疗药物具有更高的稳定性，实现组织特异性靶向以及如何避免潜在的毒性和靶外效应等。其中miRNA可能在肾脏生理和病理的不同阶段发挥不同的作用，在AKI中，肾脏微环境中的缺氧和炎症等因素会导致复杂而动态的区域异质性，临床上肾活检样本只探测一个特定的区域，不能全面检测miRNA的表达动态。为了克服这种障碍，需要研究者在疾病进展过程中对各种组织(理想情况下是在不同时间进行多次活检)进行活检样本，以确定共同的调节miRNA。

小结：在AKI背景下进行miRNA调控是一个具有重要意义和前景的研究领域，在动物实验取得的成果如能成功运用到临床上，miRNA疗法有可能使患者免于肾脏替代疗法及其相关并发症，AKI危重患者也能从中受益良多，达到阻止甚至逆转疾病进程的目标。强大的人类生物学基因组和蛋白质组数据库有助于我们识别药物开发的关键miRNA靶点，大数据的支持加上科学地分析，miRNA疗法将显示出巨大的临床潜力。