两种全自动核酸纯化仪的应用

蔡炜，于雷

（1.东阳市公安局，浙江 东阳 322100；2.上海市公安局金山分局，上海 200540）

随着近年来分子生物学技术的高速发展，以核酸杂交、核酸扩增和核酸序列分析为代表的分子诊断和检测技术在诸多领域中日益凸显出至关重要的作用。然而，所有生物学检测技术首先面临的问题就是如何从复杂多样的生物样本中快速有效地提取出高质量的基因组DNA[1]。DNA检测作为法医实验室的基本工作手段，获取高质量DNA是成功得到检测结果的关键。面对大量的案件检材，复杂多样的抑制剂类型和接触性微量检材增加了核酸提取的难度，所以，寻找一种简单快捷、DNA纯化效率高的自动化核酸纯化方法是提高破案率的有效保障，同时，自动化核酸纯化可以减少人员操作产生的失误和误差，降低人为操作造成样本污染的风险，提高结果的准确性和可重复性，实现实验室的标准化建设。

本研究主要采用德国Qiagen公司的QIAsymphony SP和QIAcube两种全自动核酸纯化仪，测试不同裂解处理和纯化程序对DNA提取纯化效率的影响，初步评估两款全自动核酸纯化仪的应用效果，为实验室核酸纯化仪的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验样本

单一来源的HEK293人胚肾细胞，购自中国典型培养物保藏中心。

1.2 主要仪器和试剂

Influx分选型流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司，QIAsymphony SP全自动核酸纯化仪、QIAcube全自动核酸纯化仪购自德国Qiagen公司，ProFlexTMPCR系统、3500xL基因分析仪购自美国Applied Biosystems公司，ThermoMixer® C恒温混匀仪、5417R离心机购自德国Eppendorf公司。

QIAsymphonyDNA InvestigatorKit、QIAamp DNA Investigator Kit购自德国Qiagen公司，VeriFilerTMPlus PCR Amplification Kit购自美国Applied Biosystems公司，20 mg/mL蛋白酶K购自德国Qiagen公司，标准品9948、去离子甲酰胺购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样本制备及实验方案设计

样本由Influx分选型流式细胞仪进行细胞计数，制备成包含30、100、150、300个细胞的棉签拭子，根据细胞数从低到高依次编号为1～4。

采用QIAsymphony SP和QIAcube全自动核酸纯化仪各自两种标准程序共4种纯化方法进行纯化（表1）。

表1 QⅠAsymphony SP和QⅠAcube的4种纯化方法Tab.1 Four purification methods of QIAsymphony SP and QIAcube

样本测试方案如下：

（1）用1、2、4号棉签拭子测试4种纯化方法的DNA提取效果。

（2）用SP1提取1、2、3号棉签拭子，测试不同的前处理裂解时间（1、1.5、3h）对纯化效果的影响。

（3）用SP1提取1、2、4号棉签拭子，测试加入二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）进行前处理裂解对纯化效果的影响。

（4）测试SP1和cube1对抑制剂的去除效果，将2号棉签拭子分别做如下处理：血红素（22000ng，添加到棉签）、腐殖酸（20000ng，添加到棉签）、猪油（浸润整根棉签）、土壤（整根棉签浸入土壤浸液）、铁锈（整根棉签擦拭铁锈）和润滑油（浸润半根和整根棉签）。

（5）另取100个细胞不做任何处理，直接提取扩增获取正确的分型图谱作为对照使用，不作为测试样本。

所有测试样本重复提取6次，平行扩增3次。

1.3.2 样本前处理

按操作说明书对棉签拭子进行裂解处理。加入475μL裂解液和25μL蛋白酶K（根据测试需求，部分样本加入DTT），在金属浴上56℃裂解1.5 h（根据测试需求，部分样本进行1、3h裂解处理），裂解完成后将样本以13 800×g离心1 min，取上清液500 μL置于2mL离心管中，根据QIAsymphony SP和QIAcube的操作说明书进行DNA纯化提取，洗脱体积设置为30μL。

1.3.3 DNA扩增和STR分型

所有纯化后提取的DNA模板，使用VeriFilerTMPlus PCR Amplification Kit，用ProFlexTMPCR系统对D3S1358、vWA、D16S539、CSF1PO、D6S1043、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D2S441、D19S433、FGA、D10S1248、D22S1045、D1S1656、D13S317、D7S820、Penta E、Penta D、TH01、D12S391、D2S1338、TPOX共23个常染色体STR基因座进行扩增。总扩增体系为10 μL，包括Master Mix 2 μL、Primer Mix 1 μL、DNA模板 7 μL。PCR 循环参数：95℃变性 1 min；96℃10 s，62℃ 90 s，2个循环；96℃ 10 s，60℃ 1 min，27个循环；60℃延伸5min。扩增产物在3500xL基因分析仪上进行毛细管电泳。采用GeneMapperTMID-X v1.5软件分析数据。

1.3.4 结果分析

基因座成功检出的标准：（1）相对荧光单位（relative fluorescence unit，RFU）>175；（2）杂合子等位基因分型均衡，同一基因座不同等位基因的峰面积差异在30%以内[2]。

采用计数法统计样本的STR基因座检出个数，将重复提取分型的样本的基因座检出个数和RFU值求和后取平均值。基因座检出率为基因座检出个数与试剂盒所含基因座个数的比值，统计分型时去除YInDel和性别基因座Amelogenin。平均RFU值=检测等位基因RFU总和/检测等位基因个数[3]。是否添加DTT进行裂解处理的样本DNA提取效果的差异比较中，分型数据使用SPSS 16.0软件进行统计分析，采用配对t检验，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 不同纯化方法的提取效果比较

用1、2、4号棉签拭子测试SP1、SP2、cube1、cube2、SP1（加DTT）共5种纯化方法的DNA提取效果，不同提取方法纯化得到的DNA经扩增和STR分型后，基因座检出率和平均RFU值见表2。

2.2 不同前处理裂解时间对DNA提取效果的影响

用SP1提取编号为1、2、3的棉签拭子，测试前处理裂解时间为1、1.5、3h时对DNA提取效果的影响，基因座检出率和平均RFU值见表3。

2.3 抑制剂去除效果比较

将含100个细胞编号为2的棉签拭子分别添加血红素、腐殖酸、猪油、土壤、铁锈和不同量的润滑油6种类型抑制剂，测试SP1和cube1程序对抑制剂的去除效果，基因座检出率和平均RFU值见表4。

表2 不同纯化方法提取的样本DNA分型结果Tab.2 DNA typing results of samples extracted by different purification methods （n=18）

表3 不同裂解时间处理后的样本DNA分型结果Tab.3 DNA typing results of samples extracted with different lysis times （n=18）

表4 SP1和cube1去除抑制剂的结果比较Tab.4 The results of removing inhibitors by using SP1 and cube1 （n=18）

3 讨 论

目前，市面上全自动核酸提取主要基于磁珠法和硅胶膜离心柱法原理。本研究中QIAsymphony SP是利用在高盐低pH值时磁珠吸附核酸、在低盐高pH值时磁珠与核酸分离的磁珠法，通过移动磁珠来实现整个纯化提取的过程[4]。QIAcube是通过盐离子浓度和pH值的调节，实现硅胶膜离心柱与核酸的结合和分离，通过离心柱高速离心来实现整个纯化提取的过程。本研究的两种方法本质上都是利用硅胶膜与核酸的结合，只是表现方式不同（磁珠和硅胶膜离心柱），所以应用两种全自动核酸纯化仪4种不同的纯化方法以及两种仪器对抑制剂去除效果的比较发现，4种纯化方法提取效果相当：提取30个细胞的棉签拭子，基因座检出率为70.83%～83.33%；提取100个细胞的棉签拭子，基因座检出率为91.67%～95.83%；提取300个细胞的棉签拭子，基因座检出率为95.83%～100.00%。由表4可见，同样100个细胞的棉签拭子，含有6种不同的抑制剂时，应用QIAsymphony SP和QIAcube提取后基因座检出率可达91.67%～100.00%，只有QIAcube提取整根被润滑油浸润的样本时基因座检出率是79.17%，表明抑制剂可被很好地去除。

此外，本研究对样本使用不同裂解时间（1、1.5、3 h）处理对DNA提取效果的影响进行了测试，并对QIAsymphony SP加入DTT行前处理裂解进行了测试。根据表3的结果可见，3个不同裂解时间处理的30、100、150个细胞的分型结果检出率相当，均在83.33%～100.00%，差异无统计学意义（P>0.05），在检测效率相同的情况下，可以选择时间短的裂解时间，实现高效的DNA提取。同样使用SP1程序提取30、100、300个细胞，加入DTT前处理裂解前后提取效果差异无统计学意义（P>0.05）。

QIAsymphony SP全自动核酸纯化仪单次可实现96个样本DNA的自动化提取，并且在仪器运行过程中可以随时加载样本到仪器中进行提取，仪器设有DNA的低温保存位置，可以在一定时间内保证核酸质量。QIAcube全自动核酸纯化仪单次最多进行12个样本的DNA提取。两台仪器均可满足DNA实验室对仪器不同通量的需求，操作过程中使用的是仪器配套的核酸纯化试剂盒，具有成熟的核酸提取程序，适用于各种类型检材的核酸提取，减少了手动提取步骤，降低了人为因素造成的误差，提高了样本检测的准确性和可重复性，实现了实验室的标准化建设。本研究只是对仪器进行了简单的使用测试，在相对定量的情况下，检测仪器在不同纯化程序和不同裂解时间等处理方式下的纯化效果，初步研究了全自动核酸纯化仪对于抑制剂的去除效果，鉴于样本数量少，且测试样本是以普通棉签拭子为载体，棉签的吸收和释放效果也会对DNA的提取效果有所影响，所以在后续的工作中还将进一步探索仪器的性能。