秦巴山区野生百合(Liliumspp.)的育种应用研究

王仙芝 牛立新 谢松林 罗建让

摘 要： 为探索秦巴山区野生百合资源在百合育种中的应用方向及途径， 获得具有其独特遗传背景的育种材料，将秦巴山区野生百合的抗病毒及独特观赏特性等优良遗传性状逐渐渗到栽培品种中去。该研究借助切割柱头杂交及胚抢救技术，选取6种秦巴山区野生百合[岷江百合（Lilium gegale）、宜昌百合（L. leucanthum）、山丹（L. pumilum）、野百合（L. brownii）、宝兴百合（L. duchartrei）、川百合（L. davidii）]以及亚洲百合（Asiatic hybrids，AA）品种‘Elite、东方百合（Oriental hybrids，OO）品种‘Sorbonne、‘Siberia和‘Marlon、OT百合（Oriental × Trumpet hybrids，OT）品种‘Yelloween、‘Serano、‘Corel′door进行了32组共计263朵花的（品）种间杂交，并针对膨大变软的果实剥离可供离体培养的胚及胚囊进行胚抢救。结果表明：（1）不同杂交组合坐果率、胚获得及萌发率呈现出较大差异，综合坐果率为11.4%，对30个膨大的果实中共计38个可供离体培养的胚及胚囊进行胚抢救，有7株最终萌发。（2）以野生百合为父母本的12组杂交组合中，6组获得了膨大果实，得到6株杂交后代。（3）栽培百合做母本，野生百合做父本的20组杂交组合中，共9组获得了膨大果实，除‘Elite × 山丹可直接收获种子外，共得到1株杂交后代。（4）以岷江百合及宜昌百合为亲本的远缘杂交TT × AA及回交OT × TT成功获得杂种后代。（5）秦巴山区6种野生百合在远缘杂交中获得育种后代的几率存在较大差异，宜昌百合和岷江百合获得后代几率较高，宝兴百合获得后代几率较低，野百合未获得后代。以上结果表明，岷江百合和宜昌百合為母本的TT × AA杂交和宝兴百合为父本的TT × AA杂交以及岷江百合和宜昌百合为父本的OT回交，为三种百合的育种利用提供了新途径，野百合的育种应用途径需要继续探索。

关键词： 秦巴山区， 百合， 远缘杂交， 胚抢救， 杂种后代

中图分类号： Q943

文献标识码： A

文章编号： 1000-3142（2020）11-1661-10

Abstract： In order to explor the application direction and approach of wild lilies from Qin-Ba mountains in breeding and to obtain breeding materials with specific genetic background， with the help of cut-style pollination and embryo rescue， six species from Qin-Ba mountains， one cultivar from Asiatic hybrids（AA）， three cultivars from Oriental hybrids（OO）and three cultivars from OT hybrids（OT）， and those 32 crossing combinations， with a total of 263 flowers were selected for interspecific hybridization， embryo and embryo sac were cultured isolated from expanded seedpots which were taken for embryo rescue. The results were as follows：（1）There was a significant differences between different recombination， the general fruit setting rate was 11.4%， 30 expanded seedpots were taken for embryo rescue， 38 embryo（sac）were rescued and finally seven plants were obtained.（2）Six hybrid plants were obtained in expanded seedpots of six crossing combinations from 12 crossing combinations when crossing between different lily species.（3）In addition to ‘Elite × Lilium pumilum can directly harvest seeds， one hybrid plants was obtained in expanded seedpots of nine crossing combinations from 20 crossing combinations when crossing cultivars as mothers and species as fathers.（4）Lilium regale and L. leucanthum were successfully used in interspecific hybridization of TT × AA and backcross of OO × TT， and hybrid plants were obtained.（5）There was a significant difference between lily species when using as crossing materials， more hybrids were abtained when crossing using species from Trumpet group（section Leucolirion）and no hybrid were obtained when crossing using species from section Archelirion and Sinomartagon. But L. brownii did not get offspring. The results revealed that TT × AA crossing using L. regale， L. leucanthum as father with Asiatic cultivars， TT × AA crossing using L. duchartrei as father， and OT × TT crossing using OT cultivars as mother and L. regale， L. leucanthum as father were new ways to breed new lily cultivars; and the way of using L. brownii still need to be explored.

Key words： Qin-Ba mountains， Lilium， interspecific hybridization， embryo rescue， filial generation

百合是百合科百合属（Lilium spp.）植物的统称，因其花大色艳、类型多样而深受世界各国人民的喜爱，成为世界第五大切花，被广泛用于盆栽及园林美化。随着经济的发展和生活水平的提高，人们对百合类型有了更广泛的需求，也对百合育种提出了更高的要求。为打破百合远缘杂交受精前障碍，20世纪60年代，切割柱头和柱头移植成功应用于百合（Myodo，1962）。20世纪90年代，试管受精得证实可帮助花粉顺利到达子房（Van Tuyl et al.，1992;Van Creij et al.，2000）。20世纪70年代，打破受精后障碍的胚培养（Myodo，1975）、子房切片培养（Straathof et al.，1987）等先后应用于百合。尤其是胚挽救技术，在葡萄（温晓敏，2018）、十字花科（赵艳艳等，2016）等多种植物中得到广泛应用，在百合杂交中经过不断比较细化（谢松林等，2010;邵阳等，2014），已经形成较为成熟的技术体系。目前，切割柱头、柱头移植结合胚抢救等技术已成为百合远缘杂交的主要方式（Van Tuyl et al.，1991;Nhut et al.，2001，2002），获得了大量商业品种。

截至2007年，百合品种数目已超过13 000个（Int Lily register，1985—2007）。自21世纪以来，远缘杂交已成为百合育种的主要方式（Van Tuyl & Lim，2003），育种家以综合百合属9个杂种系的百合品种优良性状为育种目标，形成远缘杂种及多倍体的LA（Longiflorum × Asiatic）、OA（Oriental × Asiatic）、OT（Oriental × Trumpet）和LO（Longiflorum × Oriental）等具有更多优良特性的新品种，占百合市场的份额越来越大，且有替代传统亚洲百合、东方百合及麝香百合的趋势（Van Tuyl & Arens，2010）。随着市场需求改变和育种目标调整，国际百合育种开始不再局限于品种与品种之间的杂交，已逐渐挖掘新的野生资源对现有品种进行改良，因此野生百合资源成为了百合育种中的重要材料。以分布于云南的紫斑百合为例，云南农业大学已陆续将其和栽培百合杂交，获得一系列杂种后代（郭朋辉等，2019）。全世界野生百合资源共100余种，东亚和北美分别有62个和21个野生种（Van Tuyl et al.，2011）。但是，商业百合育种中所使用的野生百合亲本占百合属极少部分，最重要的四大杂种系，即亚洲百合杂种系（Asiatic hybrid group，AA）、麝香百合杂种系（Longiflorum hybrid group，LL）、东方百合杂种系（Oriental hybrid group，OO）、喇叭百合杂种系（Trumpet hybrid group，TT）培育过程中所使用的百合野生种共计23个，在百合属总数量中占比不到25%。如喇叭百合主要亲本仅2种（McRae， 1998）;花香浓烈且对灰霉病具有一定抗性的东方百合仅源于具叶柄组6个野生种杂交（Beattie & White 1993;McRae 1998;Barba-Gonzalez et al.，2004）;对病毒及镰刀菌具较强抗性且花色多样的亚洲百合源于卷瓣组（Sinomartagon）内种间杂交（Van Heusden et al.，2002），其亲本仅12个野生种。因此，野生百合在百合育种中仍有很大的利用空间。

我国在百合野生资源分布中占有垄断性地位，共有55个种及变种，西南山区、秦巴山区及东北地区是其分布中心（赵祥云等，1991）。秦巴山区野生百合资源在百合品种培育过程中有过重要贡献，如岷江百合因其优良抗性而成为西方园林百合的优选材料，并培育出新的喇叭百合材料;川百合及山丹是亚洲百合杂种系培育过程中的重要亲本;湖北百合是亚洲百合和很多东方百合的重要亲本之一（McRae，1998）。但是综合看来，野生资源的各种优良特性尚未充分发挥，其挖掘和育种中的利用尚有巨大潜力。宝兴百合、宜昌百合、野百合尚未在百合育种中得到应用，岷江百合、川百合、山丹的优良抗病毒及蚜虫特性也未充分发挥（王仙芝等，2008）。因此，为了探索秦巴山区野生百合资源在未来百合育种中的应用方向及途径，获得具有其独特遗传背景的育种材料，将秦巴山区野生百合的抗病毒及独特观赏特性等优良遗传性状逐渐渗到栽培品种中去，本文利用经本实验室验证较为成熟的切割柱头杂交及胚抢救技术，通过秦巴山区野生百合之间，野生百合和栽培百合之间的杂交探讨其在育种过程中利用的可能性和途径，为未来百合品种改良提供方向、技术参考和材料基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选取野生百合及市场应用广泛的东方百合‘Sorbonne、‘Siberia和‘Marlon，OT杂交系的‘Yelloween、‘Serano、‘Corel′door亚洲百合‘Elite作为杂交亲本。栽培百合种球购自北京神州克劳沃园艺技术有限责任公司，百合資源圃标准种植条件下温室栽培。各种及野生种抗性及园林应用特性如表1。

1.2 花粉采集及生活力测定

将盛开的百合花药放于培养皿中，25 ℃干燥过夜，变色硅胶阴干保存。杂交前一天取少许花粉在预先灭菌的花粉萌发培养基上过夜培养，培养基配方为1/2MS+100 g蔗糖+5 g琼脂+20 mg硼酸+200 mg硝酸钙，pH=5.8，培养温度为30 ℃。解剖镜下进行花粉活性检测，取3个视野统计萌发率，求其平均值。花粉萌发率计算公式：

萌发率=（萌发花粉数/观测花粉总数）× 100%。

1.3 切割柱头杂交

1.3.1母本去雄 选取即将开放的花蕾撕开花瓣，将未开裂的花药摘去，用锡箔纸包裹柱头防止其他花粉沾上。

1.3.2 杂交 将经测定花粉萌发率在80%以上的父本花粉预先准备好，在花开后的第二天上午9：00—11：00间进行授粉。柱头切割至子房上部3～4 mm处，将柱头粘液涂抹到切割后的柱头上，棉签粘取足量花粉授到涂抹粘液后的剩余柱头上，锡箔纸包裹，2周后移去锡箔纸。详细记录杂交组合数量，离体培养前，统计坐果率。计算公式：

坐果率=（膨大果实数/杂交花朵数）×100%。

1.4 胚挽救

胚抢救参考谢松林等（2010）的方法进行。将胚放入培养基后每周检查胚的萌发情况，将萌发及生根的幼苗挑取到繁殖培养基上（Van Tuyl et al.， 1991）。统计单个膨大果实胚获得率、胚萌发率及杂种后代组成比例。各指标计算方法如下：

单个膨大果实胚获得率=胚及胚乳分离数300×膨大果实数目×100%（按正常发育情况下每膨大果实300粒胚珠计）;

胚萌发率=发育幼苗数胚及胚乳分离数×100%。

2 结果与分析

所有收集父本花粉经授粉前萌发检测，其活力均大于90%，因此可以作为父本进行杂交育种。

2.1 不同杂交组合的果实膨大及胚抢救萌发率结果

共选取6种野生百合、7种栽培百合进行了32组杂交。其中，前12组为野生百合作为父母本进行的杂交，后20组为栽培百合作为母本、野生百合作为父本进行的杂交，共对263朵花进行了杂交。杂交结果显示，32个杂交组合共获得30个膨大的果实，坐果率为11.4%。采集变软膨大的果实进行胚挽救，胚抢救过程见图版I。在25个膨大的果实中，仅获得了38个可供离体培养的胚及胚乳，单个果实胚获得率仅为0.5%。剥离出38个幼胚进行胚抢救，7个萌发，萌发率为18.4%（表2）。

2.2 野生百合种间杂交结果表现

以秦巴山区野生百合资源为亲本的杂交结果在不同杂交组合之间呈现出较大的差异性。以野生百合为父母本的12组杂交组合中，6组获得了膨大果实，分别为岷江百合 × 川百合、岷江百合 × 宝兴百合、宝兴百合 × 岷江百合、宜昌百合 × 川百合、宜昌百合 × 宝兴百合和宜昌百合 × 山丹，坐果率在20%～60%之间。除组合宝兴百合 × 岷江百合以外，其他5个组合均得到了不同数目的幼胚进行抢救，共抢救幼胚24个。以宜昌百合为亲本的3个组合（宜昌百合 × 川百合、宜昌百合 × 宝兴百合和宜昌百合 × 山丹）经胚抢救后共得到了6株杂交后代，表明宜昌百合为母本获得育种后代比率较高。

2.3 野生百合和栽培百合杂交结果表现

在栽培百合做母本、野生百合做父本的20组杂交中，共有9组获得了膨大果实，其果实膨大率在5.4%～33.3%之间，分别为组合‘Elite× 山丹、‘Yelloween× 宜昌百合、‘Yelloween× 岷江百合、‘Serano× 宜昌百合、‘Serano× 野百合、‘Sorbone× 岷江百合、‘Sorbone× 野百合、‘Marlon× 野百合、‘Corel′door× 岷江百合。其中‘Elite× 山丹可直接收获种子，‘Yelloween× 宜昌百合、‘Yelloween× 岷江百合、‘Serano× 野百合、‘Sorbone× 岷江百合、‘Sorbone× 野百合5个杂交组合中剥离出14个幼胚进行培养，最终仅得到来自组合‘Yelloween× 岷江百合的1株杂交后代，说明栽培百合和野生百合杂交获得育种材料比率较低。

2.4 基于分类学及亲缘关系分析的杂交亲和性比较

宜昌百合、岷江百合属百合属喇叭花组（Leucolirion），本组野生种经种间杂交培育出喇叭百合杂种系（Trumpet，TT）;宝兴百合、山丹、川百合属百合属卷瓣组（Sinomartagon），本组野生百合经种间杂交培育出亚洲百合杂种系（Asiatic，AA）;野百合属百合属具叶柄组（Archelirion），本组野生百合经种间杂交培育出东方百合杂种系（Oriental，OO）。

本试验杂交组合包括组内杂交AA × AA、OO × OO，组间杂交 TT × AA、AA × TT、AA × OO、OT × AA、OO × TT、 OO × AA及回交OT × TT、OT × OO。

AA × AA组内杂交结果显示：宝兴百合和其他野生种及品种杂交均无法得到膨大的果实，而山丹和‘Elite杂交，果实膨大率达到了100%，可直接收获种子;OO × OO中野百合和两个东方百合品种杂交均未得到任何膨大果实，表明组内自交获得后代成功率不一定高。

组间杂交TT × AA、AA × TT、OO × TT共计7个杂交组合获得了膨大的果实。TT × AA获得了6株杂交后代，以TT（岷江百合和宜昌百合）为母本、AA（川百合、宝兴百合和山丹）为父本的5组杂交组合中，全部可以获得膨大果实，且以宜昌百合为母本的3组胚抢救均获得成功。以AA为母本、TT为父本的4组杂交组合中，仅宝兴百合为母本、岷江百合为父本的杂交组合获得膨大果实，说明岷江百合和宝兴百合正反交都可以得到膨大果实，但反交未获得可抢救的胚及胚乳。这说明TT × AA是组间杂交唯一获得杂交后代的组合方式。

所有的回交组合均得到了膨大果实，并最终成功获得杂种后代1株，表明秦巴山区野生百合作为回交亲本成功率较高，可产生携带秦巴山区野生百合基因的中间材料。

2.5 基于不同野生种杂交应用的亲和性比较

不同野生种在32个杂交组合中的亲和性呈现较明显的差异性。岷江百合在和OT品种回交、TT × AA、OO × TT组间杂交的一些组合中均可获得不同数量的膨大果实，在以‘Yelloween为母本的回交中成功获得1株杂种后代。在宜昌百合为亲本的杂交组合中，OT × TT回交获得了膨大果实及杂种后代，组间杂交TT × AA同样获得了膨大果实及杂种后代。野百合在组间杂交中无法获得膨大果实，在組内杂交OO × OO 3个杂交组合中有2个组合及1个OT × OO回交组合获得了膨大果实，但未获取任何杂交后代。川百合在组间杂交TT和AA两个杂交组合中均成功获得膨大果实，但仅在和宜昌百合的杂交中获得了杂种后代，在OT × AA、AA × OO、OO × AA中均无法获得膨大果实。在以山丹为亲本的杂交组合中，除组内杂交AA × AA获得了膨大果实且直接收获种子外，组间杂交TT × AA也获得了膨大果实，并最终通过胚抢救获得了3株杂种后代。宝兴百合在组内杂交AA × AA和组间杂交OO × AA、OT × AA中均无法获得膨大果实及杂种后代，仅在宜昌百合作为母本TT × AA杂交中，有果实膨大但最终并未获得杂种后代。

综上结果表明，在秦巴山区6种野生百合中，属喇叭花组（TT）的岷江百合和宜昌百合作为杂交母本，AA做为父本获得育种后代比率较高。属卷瓣组（AA）的山丹和川百合在自交和TT × AA杂交组合中可获得杂交后代，宝兴百合仅在TT × AA杂交组合中可获得杂交后代。属具叶柄组（OO）的野百合未获得后代。

3 討论与结论

3.1 野生百合种间杂交与野生百合和栽培百合杂交的结果的影响因素

国外学者利用形态学，杂交亲和性及DNA保守序列将百合属分为7个组，分别为轮叶组（Martagonsection）、根茎组（Pseudolirium section）、百合组（Liriotypus section）、具叶柄组（Archelirion section）、卷瓣组（Sinomartagon section）、喇叭花组（Leucolirion section）和毛百合组（Daurolirion section）。其中，具叶柄组和喇叭花组及卷瓣组亲缘关系较近（Comber，1949;De Jong，1974;Nishikawa et al.，2007），这与本研究结果相符。本研究结果显示，对以栽培百合为母本、野生百合为父本的杂交组合而言，野生百合种间杂交更易获得育种后代，说明所选取的野生百合种间的亲缘关系较近。同时，杂交结果同样受杂交母本雌育性的影响，由于栽培百合经过多代杂交，其育性与野生百合相比难免降低，尤其是栽培百合中的OT品种，其来源是东方百合及喇叭百合的回交一代，作为异源三倍体在减数分裂中会呈现出诸多异常现象，如单价体、三价体及四价体等会引起第一次减数分裂不均衡分离，进而产生非整倍体花粉，从而导致育性大幅降低（Luo et al.，2013;Zhou et al.，2014）。因此，就秦巴山区野生百合和栽培百合品种间的亲缘关系而言，其判断依据稍显不足，有必要在后期杂交育种中加大杂交组合数量或尝试将野生百合作为母本杂交材料进行杂交育种，从而获得有力依据。

3.2 切割柱头杂交及胚抢救是秦巴山区野生百合利用的有效技术手段

远缘杂交已成为百合育种的主要方式（Van Tuyl & Lim，2003）。本研究以山丹为亲本的1个组内杂交组合可直接收获种子。这与前人研究经验相同，如De Jong（1974）和McRae（1998）对世界范围内的百合野生种进行育种技术研究，结果证实百合属组内杂交一般容易取得成功，杂交过程中不需要借助特殊方法的帮助，而组间杂交较难获得杂种后代且杂种后代高度不育，需要借助特殊授粉手段及幼胚抢救技术（Van Tuyl et al.，1991;Nhut et al.，2001;张睿婧等，2012;刘晓丽等，2012;周树军，2014;王欢等，2017）。本研究以岷江百合和宜昌百合为亲本的TT × AA杂交成功获得杂种后代，而以野百合和宝兴百合为亲本的部分组内杂交组合未得到杂交后代。其原因可能是野百合及宝兴百合由于亲缘关系较远引起常规杂交失败，进而导致尚未在百合育种中应用。因此，在运用百合野生种材料进行育种特别是和栽培品种杂交时，组间远缘杂交需要借助切割柱头授粉及胚抢救技术，组内杂交同样需要借助此类技术。

三倍体OT品种虽然雄性高度不育，但作为母本可以实现百合种质的渗入育种（袁国良等，2013）。本研究同样证实一些三倍体OT品种虽然雄性高度不育，但作为母本和秦巴山区野生百合材料进行杂交，仍然得到了少许杂种后代，与前人研究结果相符（周树军，2014;Zhou et al.，2014）。这为秦巴山区野生百合对病毒和蚜虫等具有较强抗性特征的资源利用提供了良好的实践依据。

3.3 秦巴山区野生百合育种应用途径

针对每个野生种制定合适的育种路径是秦巴山区野生百合育种应用的重要前提。育种成功与否和杂交亲本的亲缘关系密不可分，研究证实具叶柄组和喇叭花组及卷瓣组亲缘关系较近（Comber，1949;De Jong，1974;Nishikawa et al.，1999），说明LA、OA、OT及LO杂交组合结合新的育种技术相对容易取得成功，同时也是类似新品种在市场上不断涌现的原因。张睿婧等（2012）以东方百合杂交品种‘Constanta为母本，岷江百合为父本，结合胚抢救方法成功得到杂种后代;钟蕾（2016）发现OT百合品种‘仙女和‘粉冠军雌性可育而雄性不育。

Obata et al.（2000）发现具叶柄组的Lilium nobilissimum（培育东方百合亲本之一）和岷江百合成功进行了杂交，本研究以岷江百合为亲本进行的OO × TT杂交组合成功得到膨大果实及幼胚进行了抢救，同样说明了这一点。

本研究以岷江百合及宜昌百合为亲本的远缘杂交TT × AA均成功获得杂种后代，说明两种野生百合和亚洲百合亲缘关系较近，有望开拓新的育种方向，进而更快地将尚未利用的宜昌百合在育种中发挥其植株健壮高大、蚜虫抗性强的优势。本研究以岷江百合及宜昌百合为亲本的OT × TT回交也成功获得杂种后代，验证了异源三倍体作为桥梁进行育种的可行性（袁国良等，2013），为岷江百合及宜昌百合的快速利用提供了另一条捷径，有望在一次回交后筛选出优良新品种。

值得注意的是，虽然宝兴百合同属于卷瓣组，但与其他卷瓣组百合野生种及亚洲百合品种的杂交并未获得成功，这与McRae（1998）研究得到宝兴百合非亚洲百合野生亲本结论相吻合，也可能是亚洲百合的12个杂交亲本中不包括宝兴百合的原因。因此，宝兴百合组内杂交途径还需要进一步研究。然而，本研究发现宝兴百合在与宜昌百合的杂交（TT × AA）中有成功获得后代，说明宝兴百合的育种可通过与TT杂交开展，为未来宝兴百合的杂交应用开辟了一条新途径。

野百合的育种应用途径需继续探索。野百合既分布于中国也分布于日本，但作为具叶柄组成员却不是东方百合的亲本。本研究以野百合为亲本的6个杂交组合有3组得到膨大果实，但未得到杂种后代。下一步工作需要以组内杂交为主，结合特殊授粉方法及胚抢救技术寻找合适杂交亲本，尝试将野生百合作为母本杂交材料进行杂交育种。

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（责任编辑 蒋巧媛）