长链非编码RNA与复发性流产及反复着床失败关系的研究进展

赵小萱 冯晓玲 陈 璐 王 玮

1.黑龙江中医药大学(哈尔滨，150040)；2.黑龙江中医药大学附属第一医院

在真核生物基因组中，虽然有90%以上的DNA发生转录，但最终只有1%～2%的基因组转录本被翻译为蛋白质[1]。而大部分基因组转录产物属于非编码RNA( ncRNAs)[2]。这些ncRNA根据其长度可分为短非编码RNA和长非编码RNA (lnc RNA)。其中lnc RNAs 是转录本长度超过200个核苷酸的非编码RNA[3]，其作为表观遗传修饰的核心之一，在细胞生物学层面调控各个生理过程，如参与X染色体失活[4]、染色质修饰、基因组印记、转录激活、转录干扰及核内运输等，同时还能影响胚胎干细胞的多能性和分化，调控细胞凋亡和细胞周期等，在人类生命的起源、生长发育、进化选择等方面有重要作用[5-7]。lnc RNA在生命信息调控中所展现出的重要性与广泛性启发学者开始关注其对生殖疾病病因学的潜在作用。其中lnc RNA在流产相关疾病如复发性流产(RSA)、反复着床失败(RIF)中的调控机制成为学者的研究热点。RSA被定义为连续≥2次自然流产[8]。RIF指的是体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗中3次以上优质胚胎移植后的妊娠失败或多次移植10个以上胚胎后的妊娠失败[9]。无论是RSA还是RIF都受到诸多病理因素的影响，如代谢异常、免疫紊乱、炎症损伤、子宫解剖结构异常等。目前已有诸多研究表明，lnc RNA在妊娠并发症如先兆子痫、宫内高血糖、胎儿宫内受限等疾病的病理机制中发挥调控作用[10-12]，然而lnc RNA在流产相关疾病的领域中研究较少。笔者广泛阅读国内外文献，从lnc RNA调控胚胎发育能力、子宫内膜容受性、胎盘发育、胚胎-母源交互作用4个方面归纳lnc RNA对RSA与RIF的影响。

1 概述

尽管lnc RNAs与mRNA有相同的结构基础，通过RNA聚合酶Ⅱ转录，5′端加帽和 3′端多腺苷酸化，但lnc RNAs缺乏蛋白质编码的潜力[13]。与传统的蛋白编码基因相比，lnc RNAs具有表达丰度较低、表达特异性较强、序列保守性较低、位置保守性较高等特点[14]。据此可以将其分为4种类型[15-16]：①信号原型，作为转录活性的分子信号或指标；②诱饵原型，结合目标RNA或蛋白质并去除无关的RNA或蛋白质；③引导原型，指导核糖核蛋白复合物定位到特定目标指导定位；④支架原型——具有结构作用，为组装相关的分子成分(蛋白质和或RNA)提供平台。近年来，越来越多的证据证实lnc RNA与转录因子和基因表达的表观遗传学调控因子协同工作，几乎调节基因生命周期中的每一个步骤。基于不同的机制，lnc RNA可以进一步调控不同的代谢途径，参与广泛的生物过程[17]。目前研究证实，lnc RNA可通过3个水平参与基因表达的调控[18-19]：转录水平调控、表观修饰水平(包括组蛋白及 DNA 甲基化、组蛋白乙酰化和类泛素化调控)和转录后水平(m RNA前体加工和剪接、转运、翻译和降解)。通过这些调控机制，lnc RNAs可以诱导细胞分化、增殖和细胞保护等程序，这也使得lnc RNAs在调控人类疾病中所发挥的作用日益得到认可。

2 在流产相关疾病中的调控机制

2.1 通过影响胚胎发育能力导致流产发生

诸多研究表明，lnc RNA自人类胚胎发育的开始就已经存在，并在胚胎基因活化后(约为4细胞至8细胞阶段)成为主要转录产物类型[20]。随着胚胎的发育，lnc RNAs也随之发生动态改变，以表观遗传调控方式影响胚胎形态学，然而具体的分子机制仍处于研究阶段[21]。目前Inc RNAs与胚胎发育关系尚停留在胚胎干细胞(ESCs)阶段。ESCs具有无限繁殖(自我更新)能力，其功能的优劣直接决定妊娠结局[22]。研究表明ESCs中存在226个差异表达的Inc RNA，其中超过90%的Inc RNA调控ESCs基因表达，约74种与染色质重构蛋白相关的Inc RNA参与维持ESCs全能性[23]。Yin等[24]从生理层面分析了Inc RNA通过调控Haunt基因在视黄酸(RA)通路和同源盒基因(HOXA)通路下作用于胚胎干细胞的正常分化过程。Lu等[25]构建Snhg3基因敲除的小鼠模型，从病理机制层面探究 lnc RNA小核仁RNA宿主基因3(Snhg3)与小鼠胚胎发育间的关系，发现在敲除Snhg3基因后小鼠胚胎干细胞的自我更新和多能性缺失，同时小鼠的早期胚胎发育受到干扰。由此可见，lnc RNA Snhg3对胚胎干细胞功能的实现以及对小鼠早期胚胎发育起重要的调控作用。另外，国外学者发现，使用siRNA沉默小鼠ESCs中介导siRNA的启动子相关的lnc RNA后，胚胎发生致命性损伤，甚至造成流产的妊娠结局[26]。由上述一系列的实验可以确切地证实lnc RNA可通过调控ESCs的分化和发育途径影响妊娠结局。由此推测ESCs中lnc RNA的调控异常也可能是RSA与RIF的原因之一，并且在胚胎移植前对lnc RNA的筛查有望成为胚胎植入前基因筛查的重要项目。

2.2 通过影响子宫内膜容受性导致流产发生

子宫内膜容受性是指子宫内膜对胚胎的接纳能力[27]。美国的一项回顾性队列研究，调查了2011-2015年经过植入前基因筛查(以排除携带非整倍体的胚胎)的998个体外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期，发现在基因筛查后植入率仍低于60%[28]。另外一项研究比较了88例经历和未经历植入前基因筛查的RIF患者的临床妊娠率，结果显示两组结果没有差异[29]。这使学者开始认识到子宫内膜容受性不足和胚胎、子宫内膜同步化失败是RIF的主要原因。而现有研究恰恰表明lnc RNAs可调节子宫内膜容受性而影响妊娠结局。Yan等[30]的研究表明，lnc RNA H19可通过吸附let-7下调整合素β3(Integrinβ3)的转录与翻译，而Integrinβ3是反映子宫内膜容受性的金指标，当其水平下降时会引起容受性减低，导致胚胎丢失。另外Zeng等[31]以RIF患者的子宫内膜组织为研究对象，并以首次进行IVF-ET/冷冻胚胎移植周期后成功受孕患者的子宫内膜作为对照组，比较两组样本中H19 lnc RNA和Integrinβ3蛋白的表达水平，结果表明H19 lnc RNA和Integrinβ3呈正向相关性，并且两者均在 RIF 患者的子宫内膜呈现出低表达水平。由此可知H19和Integrinβ3协同作用，共同调节“种植窗口期”子宫内膜的容受性。另外，Feng等[32]以RIF女性为观察对象，借助生物信息分析技术，构建与植入失败相关的lnc RNA- mRNA网络，并寻找预测子宫内膜容受性的lnc RNA生物标志物。经拓扑分析确定了质心最高的6个关键lnc RNAs(CECR3、ST7-OT3、DHRS4-AS1、C22orf34、RAMP2-AS1、PNCT-HSA157732)及其ceRNA子网络。通过聚类分析、GO分类、KEGG通路和共表达模块进行功能富集分析后，得出这些lnc RNA及其子网络参与调控子宫内膜细胞的免疫活性，介导生长因子结合，影响血管增殖、凋亡和类固醇生物合成过程，并为胚胎植入作好内膜准备。此外，Feng等[32]在黄体中期采集16个子宫内膜样本，包括8个RIF女性和8个成功怀孕的对照组。定量实时PCR比较上述6种lnc RNAs的表达，发现这些lnc RNAs在RIF患者子宫内膜中的表达均显著升高，并且可用做预测子宫内膜容受性的生物标记物。然而lnc RNA对其下游因子如何调控还处于探索阶段，其具体分子通路机制仍需要进一步研究。

2.3 通过影响胎盘发育导致流产发生

胎盘发育是一个连续的过程，从胎盘早期滋养层细胞形成并分化，到其快速增殖、侵袭迁移，再到胎盘形态基本具备，乃至胎盘发育后期分泌、防御等功能的形成，都与妊娠的发生和维持密切相关，其中任意环节出现问题都会影响妊娠结局[33]。而滋养层细胞作为胎盘的主要组成部分，参与了胚胎着床、启动胎盘形成、调控血管分化、内分泌等过程，对胎盘发育发挥重要作用[34]。有研究表明，印记lnc RNA可调控滋养细胞功能从而影响胎盘功能及妊娠结局[35]。迄今为止相关学者已经发现100 多个人类印迹基因，而且他们大多都与生长和分化密切相关[36-37]。而其中胎盘是印记基因调控的重要靶器官之一，当印记基因异常会使胎盘滋养层细胞的分化及凋亡发生异常，从而导致胎盘的异常发育[38]。Sheng等[39]证实小鼠印记lnc RNA Rian在胎盘发育过程中逐渐高表达。 lnc RNA MEG8(RIAN)是与小鼠lnc RNA Rian同源的印记基因，位于人14号染色体上的DLK1-DIO3印记区内，而该印记区与人类生长、发育和疾病发生联系紧密[40-42]。因此，推测lnc RNA MEG8在早期胎盘发育过程中可能起重要作用。盛菲等[43]发现与正常人工流产组相比，lnc RNA MEG8在人不明原因自然流产绒毛组织中异常高表达，进一步以人早期滋养层细胞系HTR-8/Soven为研究对象进行体外细胞实验，分别转染过表达质粒和小干扰RNA，结果显示在滋养层细胞系中上调表达MEG8，可导致细胞增殖和侵袭能力减弱，下调表达MEG8则结果相反。可见lnc RNA MEG8参与调控早期滋养层细胞功能，其水平上调可造成滋养层细胞的功能缺陷，可能是引起流产不良妊娠结局的因素之一。此外，Sheng等[39]揭示了DNA甲基化与印迹lnc RNA在胎盘发育中的关系，结果提示自然流产绒毛中MEG8启动子区甲基化水平升高，这种异常的甲基化水平与滋养细胞功能缺陷关系密切。此外，其他印迹基因与胎盘功能的调控作用也被学者揭示。文献表明，印迹基因lnc RNA H19的高表达可以通过某些途径限制胎盘的生长[44-45]。有研究通过细胞实验印证了这一事实。在人胎盘滋养层JEG-3细胞中敲除印记基因H19或限制其转录产物miR-675均可起到促进胎盘增殖的作用[38]。有学者发现，RSA人群中外周血及胎盘组织中Inc RNA H19水平均高于正常妊娠流产组[46]。由此可知，lnc RNA在调控胎盘发育从而影响妊娠结局的事件中扮演重要角色。

2.4 通过影响胚胎-母源间免疫调控导致流产发生

由于胎儿携带一半的父系基因，因此妊娠被认为是半同种异体移植。而成功的妊娠则有赖于母体诸多免疫细胞和因子构建出复杂而精细的免疫调控网络，共同阻止母体对抗父本抗原的免疫激活而对胎儿产生免疫耐受，保障胎儿在宫腔内正常地生长发育[47]。相反，如果免疫调控机制受到干扰和破坏，则会导致胚胎丢失等不良妊娠结局。近年来母胎界面的免疫激活及其炎症反应成为复发性流产的一个研究热点。新近研究发现，感染和炎症通路受lnc RNAs调控[48]。Wang等[49]采用人lnc RNA芯片对正常妊娠女性和RSA女性全基因组lnc RNAs测序，并进行KEGG分析验证，结果显示差异表达的lnc RNAs参与免疫调节途径；这些lnc RNA相关基因所表达的蛋白被认为是免疫细胞分化和活化的重要调控因子[50-51]。另外，研究人员招募了20名RIF患者和30名对照组女性，在RIF患者子宫内膜组织中鉴定出742个差异表达的lnc RNA基因， 将差异显著的lnc RNAs的顺式调控靶基因进行聚类分析发现这些基因与肿瘤坏死因子信号通路、toll样4受体信号通路、NF-kB信号通路关系密切[52]。其中TLR4是一种天然免疫系统中与免疫性及炎症性疾病关系密切的重要模式识别受体，可以通过激活下游接头蛋白-髓样分化因子88(MyD88)，促使游通路活化，最后激活核因子κB(NF-κB)通路[53-54]。NF-κB作为炎症反应的一个主要转录因子，参与了炎症、免疫应答、细胞凋亡和增殖等过程的分子调控从而参与流产的发生[55]。由此可见lnc RNA通过调控胚胎-母源间免疫导致胚胎反复丢失，这可能是未来研究免疫与流产关系的一个新的方向。

3 展望

近年来，诸多文献表明，表观遗传学参与胚胎形成、生长发育等重要生命现象，并且其在疾病的预防和治疗中的作用逐渐被揭示。lnc RNA作为表观遗传学中的重要组成，凭借其作用的广泛性成为当今学医研究的“明星分子”。目前，多种分子生物学方法如转录组测序(RNA-seq)、微阵列(microarray)、RNA干扰(RNAi)和荧光原位杂交(FISH)等技术为认识lnc RNA与RSA及RIF的关系提供了强大的支持。但1nc RNA的探索还处于初级阶段，专门以RSA或RIF为研究对象的动物及实验仍属少数，许多疑问还未明晰。并且lnc RNA在细胞中的实时动态过程难以准确分析，其分子结构复杂多样，缺少适宜的生物信息学工具，难以分析其高级结构，因此无法从其分子结构直接推测出其生物学功能及调控机制。未来随着实验技术的进步，将更有助于了解lnc RNA结构与功能的关系，有望开启一个全新的由lnc RNA调控的生物信息网络，使人们可以通过不同于编码基因的角度阐明基因组的结构与功能，并为人类疾病治疗提供新的研究思路。