闽西地区猪轮状病毒流行情况分析

董 波，李静楠，傅云扉，戴爱玲，李晓华，杨小燕

闽西地区猪轮状病毒流行情况分析

董 波1,2，李静楠1，傅云扉1，戴爱玲1,2，李晓华1,2，杨小燕1,2

（1. 龙岩学院 生命科学学院，福建 龙岩 364012；2. 福建省生猪疫病防控工程技术研究中心，福建 龙岩 364012）

对2014~2017间来自闽西地区规模化猪场的173份腹泻病例，进行了猪轮状病毒（RV）的实验室诊断。结果表明，猪轮状病毒病主要发生在冬季（4.05%），其次是在春季（2.89%）。其中，与PEDV混合感染率13.51%，与TGEV混合感染率为13.51%，RV、TGEV和PEDV混合感染2.70%。2014~2017年间RV的阳性率分别为22.22%、30.90%、23.80%、2.70%。

猪轮状病毒；流行情况；RT-PCR；阳性检出率

猪病毒性腹泻病是由一种或多种病毒单独或混合感染各年龄段猪只所引发的伴有腹泻、呕吐和脱水等典型症状的消化道机能紊乱的疾病，严重阻碍了猪养殖业的发展[1]。猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus, TGEV）和猪轮状病毒（Porcine Rotavirus, RV）是引起猪病毒性腹泻的三种主要病原，三种病毒皆为接触性传播，在致病性和流行病学上极为相似，皆以呕吐、腹泻、脱水为主要特征，临床上不易分辨[2]。目前，有关仔猪腹泻的研究多以PEVD和TGEV为主[3-5]，对RV的研究较少[6]。本文对2014~2017年间闽西地区规模化猪场的173份腹泻病例，进行实验室诊断，统计RV感染情况，以期为RV的有效防控提供资料基础和理论支持。

1 材料与方法

1.1 样品

2014年1月至2017年12月间，龙岩学院动物医学研究所接诊的腹泻仔猪173例，均来自福建龙岩及周边地区规模化养猪场。取送检病例肠道组织及内容物，放置于无菌器皿中保存，并立即送往实验室诊断。

1.2 主要试剂

AxyPrep总RNA小量制备试剂盒、AxyPrep质粒DNA小量试剂盒、AxyPrep凝胶回收试剂盒，购自康宁生命科学（吴江）有限公司，dNTP、反转录酶M-MLV、5×M-MLV Buffer、pMD18-T Vector，购自宝生物工程（大连）有限公司；DL2000 DNA Marker、10×Loading Buffer，购自广州瑞真生物技术有限公司，Oligo(dT)18、Murine RNase Inhibitor、T4DNALigase、10× Ligase Buffer，购自南京诺唯赞生物科技有限公司，胰蛋白酶（Tryptone）、酵母（Yeast Extract），购自OXOID公司，Ampicillin（100 mg·mL-1）、NaCl、琼脂粉，购自Biowest公司，异丙醇、氯仿、乙醇，购自广东省汕头市西陇化工股份有限公司。

1.3 提取病毒总RNA及逆转录

剪取少量病猪的肠道组织约30 mg于研钵中，加入500 μL RNA裂解液，充分研磨，按照试剂盒操作说明书提取RNA并在-80 ℃下保存。取洁净EP管，加入RNA 11 μL、Oligo(dT)18 1 μL，12 000×g离心40 s，于70 ℃水浴10 min，加入5×M-MLV Buffer 5 μL、M-MLV 1 μL、dNTP 1 μL、DEPC水6 μL，混匀后，42 ℃水浴30 min，95 ℃水浴10 min。cDNA于-80 ℃下保存。

1.4 一步法RT-PCR

参考GenBank上已发表基因序列，使用Premier Premier 5.0生物软件设计合成一对特异性引物，

RV-F：AAAGATGCTAGGGACAAAATTG，

RV-R：TTCAGATTGTGGAGCTATTCCA。以cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应程序：45 ℃作用30 min，94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 sec，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环35次；72 ℃延伸10 min。使用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，观察并记录结果。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

采用特异性引物，PCR扩增病毒总RNA，将产物通过凝胶电泳鉴定，结果显示获得大小约为309 bp基因片段，如图1所示。将纯化产物与pUM19-T vector连接，送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序，序列结果正确。

图1 PCR扩增结果

M：DNA Maker DL2000 1：目的片段；2：阴性对照

2.2 RV单一感染以及与PEDV、TGEV混合感染情况

表1 RV感染情况统计

实验室诊断173份样品，对RV的感染情况及与PEDV、TGEV混合感染情况进行统计后显示，RV检出率为9.24%，与PEDV和TGEV混合感染检出率分别为2.89%和1.73%，详见表1。

2.3 RV发病季节统计结果

表2 各季节RV感染情况

闽西地区一年四季均有RV的感染情况，其中，RV的感染率在冬季较高，检出率为4.05%，详见表2。

2.4 RV感染年份统计结果

闽西地区2014年RV的阳性率为22.22%，2015年RV的阳性率为30.90%，2016年RV的阳性率为23.80%，到2017年RV的感染率大幅度下降2.70%，详见表3。

表3 各年份 RV感染统计

3 讨论

数据统计分析结果表明，173份病例中，共检出16份阳性病例，检出率为9.24%。闽西地区RV的感染方式为单一感染或混合感染，在混合感染病例中，与PEDV混合感染率2.89%，与TGEV混合感染率为1.73%，RV、TGEV和PEDV混合感染率为0.57%。在RV感染总病例中，混合感染率达到56.25%，表明在预防RV病的时候要重点防治RV的混合感染。

从研究结果还可知，闽西地区RV感染主要发生在冬季（4.05%），其次是在春季（2.89%），与国内学者的结论基本相符[7]。因此，猪场在冬季和春季应特别注意RV的防控。RV阳性率在2014年为16.67%，2017年为2.70%，随着年份的进程而呈现下降趋势，说明闽西地区规模化猪场在逐渐重视RV的防控。

4 结论

猪病毒性腹泻疾病仍然是影响我国养猪业的主要疾病之一。冬季和春季应特别注意对RV的预防。一是加强饲养管理，做好卫生清洁工作，确保有一个良好的饲养环境条件。二是定期给母猪注射疫苗，增强母猪免疫力，提高母猪体内的抗体水平和母乳抗体水平。

[1] 姜晶,吴丹,李男.猪轮状病毒的分子流行病学研究进展[J].吉林畜牧兽医,2015,36(4):24-28.

[2] 王冰,高玉琢,张勇力.猪轮状病毒病的流行,诊断及防治[J].现代畜牧科技,2014,42(6):142-142.

[3] 王艳丰,张丁华,李爱心,等.PEDV,TGEV,PoRV3种猪病毒性腹泻病毒的流行现状及控制策略[J].中国畜牧兽医,2018,45(2):518-527.

[4] Elschner M, Prudlo J, Hotzel H, et al. Nested Reverse Transcriptase‐Polymerase Chain Reaction for the Detection of Group A Rotaviruses[J]. Zoonoses & Public Health, 2002, 49(2): 77-81.

[5] 郝兴凡.猪轮状病毒病的防制[J].当代畜禽养殖业, 2017,38(5):17-18.

[6] 方振华,沈振国,孙倩,等.猪轮状病毒与猪传染性胃肠炎病毒混合感染的实验室诊断[J].安徽农业科学,2017, 45(14):89-90.

[7] 朱子健,闫丽辉,鞠妍,等.2015-2016年我国东北地区猪病毒性腹泻流行病学调查[J].中国预防兽医学报,2017, 39(5):356-360.

Epidemiological Analysisof Porcine Rotavirus in Western Fujian

DONG Bo1,2, LI Jing-nan1, FU Yun-fei1, DAI Ai-ling1,2, LI Xiao-hua1,2, YANG Xiao-yan1,2

(1. College of Life Science, Longyan University, Longyan 364012, China; 2. Fujian Engineering Research Center for Swine Disease Control and Prevention, Longyan 364012, China)

From 2014 to 2017, a total of 173 cases of diarrhea from large-scale pig farms in the western fujian province was collected to analyse. Results show that the main occurrence of RV occurred mainly in winter (4.05%), followed by spring (2.89%), of which the rate of mixed infection with PEDV was 13.51%, and the mixed infection rate with TGEV was 13.51%, and RV, TGEV and PEDV mixed infection 2.70%. The positive rate of RV was 22.22% in 2014, the positive rate of RVwas 30.90% in 2015, the positive rate of RV was 23.80% in 2016, while the infection rate of RV was 2.70% in 2017.

Porcine Rotavirus; epidemic situation; RT-PCR; positive detection rate

S855.3

A

1009-9115(2019)06-0059-03

10.3969/j.issn.1009-9115.2019.06.015

福建省高校自然基金青年重点项目（JZ160481），福建省教育厅中青年科技项目（JAT160483）

2019-03-19

2019-08-01

董波（1983-），男，天津人，博士，讲师，研究方向为兽医学。

（责任编辑、校对：李春香）