野生菌株特征功能基因过表达在食品领域中的研究进展

申 可，王晓丹*，周鸿翔，邱树毅，班世栋，罗小叶

（1.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳550025；2.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳550025）

野生菌株是指从自然界分离到的微生物的原始菌株，其种类繁多，具备许多特征功能，如地衣芽孢杆菌拥有较强的抑菌能力[1]，苏云金芽孢杆菌对节肢动物具有毒杀活性[2]，假丝酵母具有较强的产脂肪酶能力[3]。早期，科研者对于野生菌株的研究仅限于功能菌株筛选、菌种鉴定及培育发酵等。20世纪以来，随着分子生物技术的快速发展，基因工程被引入功能菌的构建，而基因过表达技术便是利用基因工程进行代谢改造的重要手段之一。

基因过表达技术是将含有目的基因的编码区拼接至相应的载体中，上调表达目的基因，使目的基因被过度转录、翻译，从而提高目标蛋白或目标代谢产物的产量的一门技术[4]，具有效率高、易操作、专一性强等特点[5]。将改造的功能菌投入食品行业，对于延长食品的保藏期，改善和增强食品的色、香、味及提高食品发酵效率等具有重要价值[6]。从发展战略来看，挖掘潜力之大，确有广阔的产业化开发前景。

1 基因过表达在食品领域中的研究

食品发酵过程难以控制，多菌系发酵体系还会造成菌种间的拮抗作用，生成代谢副产物，外加一些菌株的功能基因表达水平低、耐受性差等问题，都在一定程度上限制着食品企业的发展[7]。基因过表达技术的出现无疑为解决上述问题提供了突破性的思路和强有力的手段。微生物拥有丰富的酶资源，对酶资源的开发和利用尤为重要。利用该技术提高酶活性，可为食品行业提供性能优良的工程菌。纵观大量研究报道发现，基因过表达技术在食品工业中的应用主要表现在增加目标产物产量、增强野生菌株适应环境能力等方面。

1.1 增加目标产物产量

如今，防腐剂、着色剂、食用香料等食品添加剂已活跃于各类食品加工场所，大大促进了食品工业的发展，现代食品产业对其需求量也日愈增加。然而近年来发生的一些食品安全事故都与食品添加剂有关，导致人们对食品添加剂的安全性关注度逐渐提高[8]。利用生物工程技术制备天然绿色食品添加剂已成为现今的研究方向，这不仅能够解决资源短缺问题，也符合当前的消费潮流，引导食品产业升级[9]。

1.1.1 食品防腐剂

在食品防腐剂方面，乳酸链球菌素（nisin）是一种常见的具有较强杀菌能力的天然食品防腐剂，由乳酸链球菌发酵提取而得，在英国用于食品防腐已有50多年的历史，常用于乳制品、肉制品、罐头食品的质保[10]。在野生乳酸链球菌N8中过表达调控乳酸链球菌素合成的相关基因如磷酰基载体蛋白基因ptsh[11]、6-磷酸果糖激酶基因pfk及蛋白激酶催化亚基基因pkac[12]，能够提高乳酸链球菌素的产量。纳他霉素作为一种高效、安全的食品防腐剂，已被广泛应用于奶酪、肉制品、果汁饮料等领域，被美国、南美、欧盟等30多个国家批准作为食品防腐剂使用[13]。将纳他霉素生物合成基因簇中的特异性调控基因pimM、胆固醇氧化酶基因pimE导入褐黄孢链霉菌中过表达，可使纳他霉素产量较出发菌株提高了17.77%和19.56%[14]。

1.1.2 食品着色剂

在食品着色剂方面，靛蓝是一种安全的食用色素，在食品呈色中起重要作用。据文献报道，假单胞菌属[15]、红球菌属[16]及不动细菌属[17]等微生物中含有加氧酶或羟化酶，是生物合成靛蓝色素的优势微生物。通过筛选高产靛蓝色素的野生假单胞菌B4，并扩增其中的苯乙烯单加氧酶基因styab，与表达载体pBK-CMV连接后转化至原宿主表达，能够较好地提高天然靛蓝色素的产量[18]。

1.1.3 食用香料

食用香料常用来配制食用香精或直接给食品加香，利用基因工程技术研究生产天然香料已备受香料界的关注[19]。2-苯乙醇具有玫瑰香气，常作为食用香精为面包、啤酒等食品增香。酵母菌是其生物合成主要微生物，其中的脱羧酶基因ARO是关键合成基因。克隆ARO10基因并构建重组质粒后导入酿酒酵母S288C中过表达，可使转化菌的2-苯乙醇的质量浓度提高至1.0 g/L，较原始菌提高16%[20]。在酿酒酵母W303-1B中同时过表达脱羧酶基因ARO80、ARO9和ARO10基因，能使2-苯乙醇产量较原始菌提高3.1倍[21]。乙偶姻具有令人愉快的奶油香味，常用于配制奶香型、草莓香型香精或直接用于奶制品增香，枯草芽孢杆菌是其生物合成的重要微生物[22]。在枯草芽孢杆菌JNA 3-10中分别过表达α-乙酰乳酸合成酶基因alsS和α-乙酰乳酸脱羧酶基因alsD，可使乙偶姻产量较野生菌提高5.2%和4.1%[23]。

1.1.4 白酒酯类

构建高产酯类的酿酒酵母并用于白酒生产是基因过表达技术的另一研究热点[24]。中国白酒中酯含量较低，仅达到2%左右，酿酒酵母的产酯能力也极低，难以大量合成酯类物质，这些问题已长期困扰我国白酒界[25]。将高产酯类工程菌用于白酒酿造，不仅能提高单位时间内的产酯量，缩短发酵周期，减少粮耗，还能取代产酯微生物窖泥，避免窖泥微生物发酵产生异味物质。目前，已有大量关于提高浓香型白酒中己酸乙酯主体香含量的研究报道。研究者们通常选取磷酸甘油酸激酶基因pgk1作为上游调控元件，在其控制下过表达醇己酰基转移酶基因eht1、乙酰辅酶A羧化酶基因acc1、脂肪酸合成酶1基因fas1及脂肪酸合成酶2基因fas2，将代谢通路定向至脂肪酸的合成，提高己酸乙酯的产量，促进果香形成[26-27]。李锋等[28]曾在酿酒酵母AY15中过表达eht1，使己酸乙酯产量提高为原菌种的2.21倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯含量也分别提高了31.4%和49.1%。尽管目前鉴于食品安全问题，酿酒行业尚未将基因工程菌应用于实际生产，但工程菌的潜在价值是不可否认的。如何在安全规范、避免危害的前提下应用它，是进一步的研究方向。

1.2 增强野生菌株适应环境能力

食品发酵对微生物菌种有严格要求，微生物对发酵环境如温度、pH、盐分的适应能力是决定其能否成功投入工业化生产的重要因素。一些野生菌为了适应极端环境，往往会在其细胞内形成多种具有特殊功能的酶，这对食品发酵生产是十分有用的。基因过表达技术可以提高功能酶基因在菌株基因组中的占比，增加特定酶的产量，促进菌株适应环境。

1.2.1 耐高温

醋酸菌在酿造食醋风味形成方面具有突出作用，其最适发酵温度为30 ℃，夏季高温会严重影响发酵速率。近年来，日本等国成功利用基因工程技术改良醋酸菌的耐高温特性[29]。据报道，热休克蛋白dnaK能在调节蛋白dnaJ的协助下耐高温胁迫[30-31]，启动子groESL易调控，在热诱导条件下能加速转录。通过过表达dnaK、dnaJ及groESL基因，可以增强醋酸菌对高温的耐受性，即使在42 ℃高温条件下也能正常生长。

1.2.2 耐酸

在食醋酿造过程中，醋酸菌的耐酸能力直接影响其生产效果。高酸度的酿造醋不仅能够节省储存空间，方便食品加工业使用，还能在一定程度上抑制杂菌污染，减少生产损耗。醋酸菌发酵过程中的乙醛脱氢酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）与其耐酸性呈正相关，在醋酸菌中过表达ALDH酶基因，能够提高菌种的耐酸性，最高耐酸度可达到98.6 g/L[32]。SHIGERU N等[33]研究发现，醋酸菌细胞膜中的蛋白质AatA是ABC转运蛋白家族的一员，对醋酸、蚁酸、柠檬酸等具有耐性。通过在醋化杆菌中过表达aata基因，使工程菌在90.0 g/L时产平均酸速率较导入前40.0 g/L时速率几乎相同，可以实现醋酸菌的耐高酸，并保持稳定的产酸速率。

1.2.3 耐盐

耐盐微生物在酱腌菜、调味品、肉的腌制品等盐渍食品中应用得较多，通过正常的发酵作用，能抑制有害微生物的活动而起到防腐作用。食品中常见的耐盐微生物有鲁氏酵母菌、球拟酵母菌及葡萄球菌[34]等。鲁氏酵母中的Na+/H+-反向转运蛋白基因ZrSOD2与细胞膜H+-ATP酶基因ZrPMA1二者在耐盐性中起到明显的协同作用。构建含ZrSOD2和ZrPMA1基因的表达载体，导入酿酒酵母中过表达，能赋予酵母稳定的耐盐性[35]。将具有耐盐功能的大麦水通道蛋白基因HvPIP2;5和锌指蛋白基因oslol5扩增后分别连接至质粒pYES2，并转化至酵母菌中，均可增强其在高盐渗透条件下的耐受性[36-37]。

2 工程菌的安全性及转基因食品检测技术

随着人们生活水平的提升，食品安全问题备受关注，尤其是各国多年来频繁出现许多食品安全事件，使得转基因食品的安全性引起大家的争议。虽然截止目前还未有实例报道工程菌在食品行业应用上存在明显的危害性，但从理论角度出发，无论是技术性还是工业生产性，在一定程度上均存在一些弊端。在技术上，目的基因的过量引入可能会引起转录缺陷，激活其他代谢途径，造成菌株恶性突变，在投入食品发酵过程中生成有毒、有害或其他引起食品变质的物质，严重损害食品质量，或是可能在融入食品后进入人体，对人体组织、细胞造成严重危害[38]。在工业生产上，工程菌属于外源菌种，参与食品发酵可能会破坏原始菌群结构的平衡，对发酵环境造成不可修复的破坏。因此，采取有效的食品安全检测技术对于保障食品安全、人体健康及降低对食品发酵环境的影响极其重要。

目前，常用于检测转基因食品的技术有单管巢式和半巢式聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术[39]、环介导温扩增法[40]、液相芯片技术[41]及试剂条法[42]等。ZHOU D G等[43]运用环介导温扩增法检测转基因甘蔗中的cry1Ac基因，结果最低检出限为1.0 ng/μL。FU K等[44]对13种转基因玉米品系进行多重PCR-液相芯片检测，结果灵敏度达到0.1%，且探针和引物之间特异性较高。我国中科院生物技术研究所也研制出金杯免疫检测试纸条[45]，可快速检测转基因植物中的Bt-Cry1Ab蛋白和Bt-Cry1Ac蛋白。

可见，无论是检测效率、灵敏度还是适用范围，转基因食品检测技术的发展都迈向了新台阶。科技在不断进步，技术在日益更新。相信在科研工作者孜孜不倦的研究下，基因过表达技术的弊端会逐渐减少，检测技术会更加快速准确，以确保转基因食品的质量安全。

3 展望

具有特征功能的野生菌株是发酵食品行业的珍稀资源，但自身功能基因表达水平低、耐受性差等问题一直阻碍着人们对其的开发利用。而基因过表达技术在改良微生物菌种方面的能力非常突出，给多样的菌种世界带来了无限的可能性，它不仅能解决食品行业资源不足的问题，为食品的色、香、味和贮藏提供有力保障，还能提高耐受性基因在菌株基因组中的占比，实现工程菌的“身强体壮”，更好地满足食品行业的生产需求。在一定程度上，野生菌株与基因过表达技术之间彰显出较好的适配性，无论是菌株资源的充分利用，还是生物技术的强效运用，都是推动社会工业化发展的润滑剂。

但是，由于人们对野生菌株的功能特性、生理生化特性及毒理学特性认知不全，基因过表达技术对于食品领域而言也存在安全性质疑，两者结合是否会出现1＋1＞2的安全问题还需要更多的实践证明。如何正确对待这些问题，关键是要将争议搁置，在筛选野生菌株时做好全面细致的生理生化试验与毒理学试验，充分发挥基因过表达技术在微生物资源改造和利用方面的优势，不断挖掘利用转基因食品检测技术，制定完善的食品法律法规条例，使基因过表达技术和食品行业同步发展，才能更好的造福于人类，加速食品工业现代化进程。