海蛇科毒素生化性质及作用机理研究进展

王湘君,王雅楠,陈 文,罗 蒙,林杰曼

(1.海南热带海洋学院 a.水产与生命学院 b.两栖爬行动物研究省级重点实验室;c.海洋科学技术学院,海南 三亚 572022;2.南京师范大学 生命科学学院,南京 201146)

0 前言

海蛇科(Hydrophiidae)隶属于爬行纲(Reptilia),有鳞目(Squamata)、蛇亚目(Serpentes).其主要特征为:鼻孔背位,无鼻间鳞,腹鳞较小,甚或退化消失,卵胎生或胎生,产仔.我国已知3种扁尾海蛇:蓝灰扁尾海蛇(Laticaudacolubrina)、扁尾海蛇(L.laticaudata)、半环扁尾海蛇(L.semifasciat).扁尾海蛇属在某种程度上属两栖海蛇,定期离开水.交配时会回归到陆地,雄性会以抽动身体的姿态来向雌性示爱.卵生.雌性把卵产在陆地.栖息于浅海和珊瑚礁.主要食物为鱼.还有棘鳞海蛇(AstrotiaAcalyptophis)、棘眦海蛇(Acalyptophisperonii)、青环海蛇(Hydrophiscyanocinctus)、青灰海蛇(H.caerulescens)平颏海蛇(Lapemiscurtus)海蛇亚科有14个属约55种,分布于非洲东岸沿海到热带美洲西岸沿海,长吻海蛇分布贯穿此广大海域,其余种类均限于此范围内沿岸浅海,一些种类特化只适于摄食1～2种类型的鱼类或只吃鱼卵,头体长一般0.5～1 m,棘鳞海蛇全长可达1.6 m.我国已知有8属13种.

1 常见海蛇的毒素成分

赵延德[1]研究发现海蛇蛇毒与眼镜蛇毒相似,主要毒性成分是突触后神经毒素.钟肖芬等[2]发现海蛇毒素为神经毒素和细胞毒素,海蛇毒素中以神经毒素为主.神经毒素分为突触前神经毒素和突触后神经毒素,根据蛋白质氨基酸序列和功能的不同,突触后神经毒素分短链神经毒素和长链神经毒素.

Kim H S等[3]发现神经毒性蛋白是以一种结晶形式从扁尾海蛇、蓝灰扁尾海蛇的毒液中分离而来.两种的毒素氨基酸组成和其他性质相似,从而得出结论,这两个物种分泌相同的毒素,该毒素被命名为扁尾蛇毒素A.

吴方辉等[4]研究发现半环扁尾海蛇毒液主要成分是神经毒素,短链神经毒素(ETX)存于该蛇中.曾家荣等[5]实验证明平颏海蛇蛇毒初步测定为突触后神经毒素.陈家树等[6]实验得到平颏海蛇毒同时有肌肉毒和神经毒,神经毒是平颏海蛇的主要毒素成分.梁京生等[7]分离纯化平颏海蛇神经毒组分Ⅷ-2-4,发现组分Ⅷ-2-4很可能是属突触后长链神经毒素.王博[8]通过将平颏海蛇和青环海蛇的毒素比对得出二者蛋白组成相似,主要为神经毒素.

2 毒素理化结构与性质

2.1结构

2.1.1 半环扁尾海蛇

半环扁尾海蛇毒素c由62个氨基酸残基组成,比半环扁尾海蛇b少了Asp(或Asn).Nobuo Tamiya等[9]得出结论半环扁尾海蛇毒素c是[51-天冬酰胺]-半环扁尾海蛇b.Endo T等[10]研究表明存在于半环扁尾海蛇中的ETX共有62个氨基酸残基,4对二硫键,呈三指型半环状空间结构.

2.1.2棘鳞海蛇

Maeda N等[11]测得棘鳞海蛇毒素的氨基酸序列为:Met-Thr-CmCys-CmCys-Asn-Gln-Gln-Ser-Ser-Gln-Pro-Lys-Thr,分子量为6 600.毒素B和C分别是由70和72个氨基酸残基与十个半胱氨酸残基组成.

Endo T等[12]研究表明棘鳞海蛇B和C毒素的分子构象是长轴phe-25神经毒素.维持稳定靠Ile/val-42,Ala-46和Ile-58疏水键相互作用,而不是其他神经毒素Tyr-25和Glu-42之间的氢键.

2.1.3蓝灰扁尾海蛇

Hyung S K等[13]蓝灰扁尾海蛇毒素Lca、Lcb分子中含有69个氨基酸残基8个半胱氨酸残基.毒素Lca和Lcb在序列31,32,33,50和53位氨基酸不同.毒素Lca与Lcb含4个二硫键,整个氨基酸序列是同源长链神经毒素,毒素Lca和Lcb检测误差为6%.

2.1.4棘眦海蛇

Endo T等[14]对毒素测定得棘眦海蛇的氨基酸序列为:Trp-Tyr-Met-Val-Asp-Leu-Ala.Mori N等[15]表明棘眦海蛇毒素分子结构由60个氨基酸残基的氨基端和Met、Asn的羧基末端组成,含有九个半胱氨酸残基.

2.1.5平颏海蛇

Servent D等[16]和Tamiya T等[17]指出平颏海蛇中短链神经毒素含60～62个氨基酸残基,4对二硫键.长链神经毒素由66～79个氨基酸残基5对二硫键构成.短链神经毒素具有一个共同的三指环结构,环I含4～16位氨基酸残基,环II有25～40位氨基酸残基,环III为44～53位氨基酸残基.钟肖芳等[2]发现平颏海蛇短链神经毒素SN12、SN36和SN160之间只存在第46位氨基酸残基的差异,但生物活性上有明显区别.

2.1.6青环海蛇

Li P S等[18]在青环扁尾海蛇毒素中发现三个不同基因,命名sn311、sn316、sn285三个基因编码不同的短链α-神经毒素,含有21个氨基酸的信号肽和60个氨基酸的成熟肽.基因sn311和sn316编码的成熟肽同源性高,唯一差别是Lys46和Ser46不同.而sn285编码的成熟肽缺乏稳定氨基酸,如Asp31和Arg33.

2.2性质

李其斌等[19]认为,海蛇毒毒性较稳定,经100 ℃,5 min处理后仍能保持毒性,在酸、碱环境下也同样稳定.

2.2.1半环扁尾海蛇

Nobuo T等[20]估计半环扁尾海蛇毒素的相对分子量为7 000.

Nobuo UI等[21]研究表明半环扁尾海蛇毒素a和b显示相同等电点为PH 9.68.对于[1-N-乙酰精氨酸],[15-N6-乙酰基赖氨酸盐],[27-N6-乙酰基-赖氨酸],[47-N6-丙酰基-赖氨酸]和[51- N6-乙酰基-赖氨酸盐]在半环扁尾海蛇毒素b的pH值分别9.52,9.31,9.45,9.22和9.09,半环扁尾海蛇毒素c的等电点和[51-天冬酰胺]-半环扁尾海蛇毒素b、[51-N6-乙酰基-赖氨酸]-半环扁尾海蛇毒素b是相同的.

2.2.2棘鳞海蛇

Maeda N.等[11]572研究表明棘鳞海蛇毒液包括酰胺化的C-末端的长链神经毒素蛋白.

2.2.3青环海蛇

苏拔贤等[22]研究表明,蛇毒是由蛇的毒腺分泌的含有多种毒素、蛋白质、多肽、酶类和其他小分子物质.Li PS等[18]青环海蛇蛇毒提纯后,得到约10 mg·L-1的重组蛋白,其纯度可达95%.

万德源等[23]用考马斯亮法测得青环海蛇毒素蛋白质含量为97%,为低分子量蛋白组.Mackessy等[24]指出在青环海蛇的毒液较小的毒素占主导,特别是3Ftxs和PLA2.Juan J.Calvete等[25]研究表明青环海蛇毒液中发现17个蛋白( 5个type-I PLA 2分子 和12个3Ftxs分子).毒液中3Ftxs占81%,type-I PLA 2占19%.青环海蛇毒液蛋白质组只有6种毒液组分3种短链神经毒素,2种长链神经毒素,一分子PLA 2.

Saeedeh M K等[26]研究表明青环海蛇的毒液中短链神经毒素,长链神经毒素和碱性磷脂酶A2,其分子量估计分别为7 285 Da,10 838 Da,和14 235 Da.

2.2.4平颏海蛇

吴祥褆等[27]在早年研究中发现平颏海蛇毒中所含的乳酸脱氢酶量较多,推测这可能是海蛇科毒蛇原蛇毒中LDH远较其他蛇科强的原因之一.

卓肇文等[28-29]证明平颏海蛇中胰蛋白酶能催化水解碱性氨基酸的羧基所组成的肽键和酯键,并发现蛇毒中的蛋白酶抑制剂的功能可能是对蛇毒中的其他活性蛋白质与多肽起保护作用.

1990年我国广州中山医科大学药理教研室实验发现平颏海蛇肌肉毒素约占粗毒总蛋白量的32.2%;神经毒约占粗毒蛋白质总量的52.3%[30].

吴世海等[31]从北部湾平颏海蛇粗毒分离出7种毒素,分别命名为平颏海蛇毒素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ.进一步通过实验分析表明平颏海蛇毒素Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ为短链毒素,而毒素Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ为中链毒素.

周琦等[32]通过多种研究方法对广西沿海平颏海蛇和青环海蛇进行分析,表明两种海蛇的总氮量、蛋白质、氮基酸、脂肪酸、灰分、重金属和微量元素的组成和含量相近.

2.3磷脂酶A2

苏拔贤等[33]研究表明平颏海蛇中磷脂酶A-2对钙、钠、镁、锌、铜具有抑制作用.

Arni R K等[34]发现蛇毒PLA-2除了酶活性外,还具有多种生理活性,如神经毒、心脏毒、肌毒、细胞毒、溶血作用、抗凝集作用等.这些活性或者与酶活性相关,或者完全独立于酶活性之外.

杨文利等[35]专门研究了平颏海蛇毒磷脂酶A-2基因多样性.平颏海蛇毒腺中至少含有3种不同PLA-2,大致可分为酸性和弱碱性.推算三者等电点,发现这3种PLA-2均属于Ⅰ类磷脂酶A-2家族.其中PLA2-8与澳大利亚虎蛇(Notechisscutatusscutatus)的PLA2有81%同源;而PLA2-9和PLA2-384则钩鼻海蛇(Enhydrinaschistosa)的肌毒PLA290%同源.之后又发现PLA2-9具有与天然PLA2相近的酶活性;并具有对HL60等几种肿瘤细胞的细胞毒作用[36].

欧阳平等[37]研究表明重组平颏海蛇磷脂酶A-2具有明显的抑制基础生长状态下的大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用.试验表明rPLA2能明显抑制由晚期糖基化终产物刺激的大鼠血管平滑肌(VSMCs)增殖[38].研究表明，利用基因工程技术获得的rPLA-2在一定剂量下对成纤维细胞增殖有明显的抑制作用[39].

王博等[8]65指出，平颏海蛇和青环海蛇毒素蛋白组成相似,均以神经毒素和磷脂酶A2为主.

3作用机理

海蛇毒致死主要是其毒液中分离出来的α-神经毒素的毒性作用,它竞争结合于骨骼肌突触后膜上的烟碱型乙酰胆碱受体,阻断乙酰胆碱与受体结合,导致神经肌肉接头传递阻断,阻断胆碱能神经肌肉接头,引起麻痹.毒素作用于乙酰胆碱受体,使兴奋一直保持,即麻痹作用一直存在,导致肌肉无力、酸痛、眼睑下垂,严重则导致心脏和肾脏损伤,最终死亡.另外肌肉毒素作用于横纹肌,使横纹肌细胞损害释出钾离子、肌红蛋白,高血钾可引起心脏抑制,肌红蛋白堵塞肾小管引起急性肾功能衰竭.除了突触后神经毒素能引起神经肌肉阻断外,所含的磷脂酶A2也有肌肉毒性,对肾、肝、肺有一定的破坏作用[40-41].

Karthikeyan R等[42]实验表明平颏海蛇的毒性较强,在小鼠的腹腔试验中,平颏海蛇的毒液可以引起坏死、水肿和细胞浸润,出现空腔化等现象.

4 总结

本文通过阅读国内外有海蛇蛇毒文献和期刊得出,和大多数毒蛇一样海蛇蛇毒大部分以神经毒为主,不同海蛇毒素中成分有不同,有相似的部分.海蛇咬伤由于海蛇毒牙较小,并垂直刺入的特点,相较于其他咬伤不易察觉.毒力也在毒蛇中较强.近几年来,对于扁尾海蛇属的研究越来越深入,研究的文献较多,涵盖领域包括神经毒素、生物合成、理化性质、分子序列结构、作用机理等方面.尤其是对半环扁尾海蛇和平颏海蛇的神经毒素的研究较广,是国内外研究者的研究热门课题之一.而对于其他海蛇,在国内只研究其微量元素,在国外的文献中,也很少相关的具体描述资料.海蛇血清的应用率较其他毒蛇类应用率较低,研究其结构、作用机理有利于海蛇毒素的药用价值及经济价值,这有待相关学者进一步的开发研究.