多囊卵巢综合征患者子宫内膜的蛋白质组学研究

朱 宇 王 磊 赵红翠 甄秀梅 马 旭 高华方*

1.北京协和医学院研究生院(100730)；2.国家卫生健康委科学技术研究所；3.北京大学第三医院

多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄女性常见的内分泌代谢紊乱疾病，涉及内分泌和免疫调控等复杂环节[1]。在育龄期妇女发病率为 4%～18%[2]。目前研究认为，PCOS患者妊娠困难，并且具有较高的流产、早产等不良妊娠结局风险[3]。Palomba等[4]研究结果表明，PCOS患者患妊娠高血压和先兆子痫的风险比普通人增加3～4倍，早产风险增加2倍。还有研究表明，PCOS流产率为25%～73%，显著高于健康人群[5]。子宫提供胚胎植入与发育的场所，与妊娠密切相关，本实验以人子宫内膜活检组织为样本，利用液相色谱串联质谱( LC-MS/MS)技术对内膜细胞的蛋白分子进行鉴定和比较，找到PCOS患者异常表达的蛋白，并通过生物信息学分析寻找相关生物通路，从分子角度提供其致病机制研究的线索。

1 资料与方法

1.1 一般资料

子宫内膜活检组织样本来源于2018年9月10-20日就诊于北京大学第三医院的不孕患者，其中PCOS组(n=15)，临床诊断为PCOS(2003年鹿特丹诊断标准)，对照组(n=12)临床诊断为非PCOS的不孕症患者。本研究经北京大学第三医院伦理委员会审批，患者均签署知情同意书。

1.2 方法与质谱条件

对冰冻子宫内膜组织进行预处理，经蛋白提取，胰酶酶解，C18除盐后上机检测。采用Q ExactiveTMHF-X质谱仪，ESI离子源，离子喷雾电压2.5 kV，离子传输管温度为 320°C，质谱全扫描范围为 350～1500 m/z。

1.3 统计学分析

RStudio(3.5.1)统计学分析，对每种蛋白在PCOS组和对照组的定量值进行T-test检验，P<0.05(双侧)为具有统计学意义。生物信息学分析采用京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。

2 结果

2.1 两组间蛋白表达的差异

联合UniProt数据库对质谱数据进行蛋白鉴定和分析，共鉴定出蛋白7285种，其中在PCOS组和对照组均鉴定到的蛋白共6920种。计算各种蛋白在两组样本间表达量的差异倍数(FC)。

以FC≥2.0，P<0.05为条件筛选上调蛋白，以FC≤0.5，P<0.05为条件筛选下调蛋白， 得到PCOS组上调表达蛋白290种，下调表达蛋白141种。对431种差异蛋白进行分析，分别以log2(FC)为横轴，以-log10(P)为纵轴，对蛋白绘制火山图。如图1(1721页)所示，上调蛋白和下调蛋白有很好的区分度。对差异蛋白在每个样本的表达量进行Z值校正后进行聚类分析，结果PCOS组和对照组也被明显聚合成两类，PCOS组和对照组有明显的组间差异，见图2(1721页)。

2.2 差异蛋白的生物信息学分析

对差异表达蛋白进行KEGG富集分析，找到差异蛋白主要参与的生物通路。结果参考P值、富集比例(该通路上注释的差异蛋白数目/该通路上注释的背景蛋白数目)、该通路上注释的差异蛋白数目3个条件，显示前20条显著富集的通路见图3(1721页)。结果显示，在色氨酸代谢，酪氨酸代谢和苯丙氨酸代谢等一些通路中，差异蛋白富集较为明显，其中色氨酸代谢通路富集最为显著。涉及的差异蛋白分别为犬尿氨酸-3-单加氧酶、醛氧化酶1、胺氧化酶、HCG23341蛋白、胺氧化酶(含黄素)A、胺氧化酶(含黄素)B、2-氧戊二酸脱氢酶。

3 讨论

PCOS发病机制复杂，以往经验性用药对一些长病程患者治疗效果不理想，从分子角度探寻致病原因并找到新的治疗方式十分必要[6]。

随着组学技术的发展，国内外对PCOS的研究已取得一定进展。Amjadi等[7]对PCOS子宫内膜组织进行2D-凝胶电泳联合质谱检测，筛选到包括组织蛋白酶D-蛋白、14-3-3蛋白等70种差异表达蛋白，这些蛋白参与细胞代谢、氧化应激、免疫反应、凋亡等生物过程，对生殖功能发挥重要作用，参与解释PCOS子宫内膜病变。在本研究中，通过对PCOS组和对照组的子宫内膜进行蛋白质组学分析，发现431种差异表达蛋白，对其进行KEGG富集分析。结果表明,差异表达的蛋白主要在色氨酸代谢、酪氨酸代谢、苯丙氨酸代谢等生物通路中发挥作用。

对富集最显著的色氨酸代谢通路进行深入分析，发现包括胺氧化酶(含黄素)A、胺氧化酶(含黄素)B、犬尿氨酸-3-单加氧酶、HCG23341在内4种差异蛋白通过催化不同的生化反应，参与色氨酸-犬尿氨酸代谢途径，可能造成3-羟基-L-犬尿氨酸、L-犬尿氨酸、4,8-二羟基喹啉等代谢产物浓度的改变。犬尿氨酸代谢途径是色氨酸代谢的关键途径，约95%的色氨酸代谢通过此途径完成[8]。有研究发现，色氨酸-犬尿氨酸代谢途径的产物犬尿氨酸等物质可以通过结合芳香烃受体，介导T细胞失能和凋亡，造成免疫反应异常[9]。推测，PCOS患者子宫内膜可能因为色氨酸-犬尿氨酸代谢途径的代谢产物浓度的变化，产生免疫稳态的改变。

色氨酸-5羟色胺代谢途径的代谢产物5-羟色胺是差异蛋白胺氧化酶(含黄素)A和胺氧化酶(含黄素)B作用的底物。有研究发现，在子宫内膜检测到的5-羟色胺除了作为神经递质发挥作用，还可能通过在妊娠的不同阶段与配体结合，影响细胞增殖，参与妊娠调节[10]。细胞增殖分化能力与子宫内膜容受性密切相关，影响胚胎植入结局[11]，这说明PCOS子宫内膜5-羟色胺浓度的变化与子宫内膜容受性的关系也值得关注。

在色氨酸代谢网络中，还发现差异蛋白2-氧戊二酸脱氢酶可以催化生成戊二酰辅酶A，戊二酰辅酶A可以作为前体，通过下游多重生化反应，最终生成乙酰辅酶A 。乙酰辅酶A是三羧酸循环和氧化磷酸化的关键分子，与细胞供能密切相关，由此推断PCOS子宫内膜的细胞供能也许发生改变。

目前，关于PCOS子宫内膜蛋白质组学的研究不多。在本研究中，尽管严格控制实验操作条件，但由于样本数量的限制，一定程度影响了研究结果的普适性，在后续的研究中我们将扩大样本量，并对相关代谢产物的浓度进行检测，为PCOS致病机制的研究提供更多线索。