早期梅毒患者治疗前后白细胞介素-27、33和γ干扰素的检测及分析

蒲新露

梅毒（syphilis）是由梅毒螺旋体（Treponema pallidum）引起的一种慢性传染性疾病，主要通过性接触及血液传播[1,2]。近年来，发病率有上升趋势。梅毒早期以侵犯皮肤黏膜损害为主，晚期常伴有心血管、中枢神经系统、骨骼及眼等器官的器质性损害[3]。有学者认为梅毒血清学固定的发生与患者免疫功能异常相关[4,5]。

近年来，国内外已有相关文献报道Th1 型细胞因子在清除梅毒螺旋体的免疫应答中起重要作用，而Th2 型细胞因子则在血清不转阴的患者中占优势[6]，其中分别以白细胞介素(IL)-27 及IL-33 为主。本研究将探讨IL-27、IL-33 分别作为Th1、Th2 细胞的活化因子在梅毒患者清除体内梅毒螺旋体的免疫应答中所发挥的作用。探究早期梅毒患者在治疗前是否已存在IL-27、IFN-γ 及IL-33 水平的差异及此差异是否影响其预后，为评估病情发展及进一步研究和有效治疗梅毒患者提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 随机选取2015 年1 月―2015 年12 月至上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院就诊的早期梅毒患者70 例，经正规苄星青霉素G 驱梅治疗6 个月后，根据治疗效果将其分为梅毒血清转阴组、梅毒血清未转阴组，最终每组入选25 例，同时收集25 例正常健康人血清及全血标本作为对照组。分别抽取正常健康人、早期梅毒患者治疗前后的血清及全血样本用于本实验检测分析。实验分组：对照组25 例（男13 例，女12 例），年龄 20 ～55 岁，平均年龄（35.6±5.7）岁；梅毒血清转阴组25 例（男11例，女14 例），年龄18 ～57 岁，平均年龄（34.3±6.2）岁；梅毒血清未转阴组25 例（男12 例，女13 例），年龄21 ～60 岁，平均年龄（35.8 ±5.6）岁。本研究已通过我院医学伦理委员会的批准，获得患者的知情同意。

1.1.2 纳入标准 所有入选的梅毒患者诊断均符合中国疾病预防控制中心性病控制中心颁布的《性传播疾病临床诊疗与防治指南》，①年龄18 ～60 岁；②一期与二期梅毒或早期潜伏期梅毒；③血清快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）滴度为1:4～1:32的患者。

1.1.3 排除标准 ①年龄＜8 岁或＞60 岁；②既往感染过梅毒；③并发严重的心、肺、肝、肾等器质性疾病；④非自愿或拒绝参与此项临床研究者。

1.1.4 试剂与仪器 IL-27，IL-33，IFN-γ 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（上海广瑞生物科技有限公司），反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（美国Invitrogen 公司），荧光定量PCR 试剂盒（2*SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix）（美国Fermentas 公司）。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及ELISA 检测 对入选的各组受试者在治疗前、治疗后分别采取外周血5 ml，放置于无菌离心管中以 3 000 r/min 离心5 min，吸取部分血清行RPR、梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）检测。早期梅毒患者血清RPR 滴度为1:4 ～1:32，剩余血清样本分装（标注姓名、性别、采集日期）后放置于-80℃冰箱储存备用。采用双抗体夹心ELISA 法，严格按照所购试剂盒说明书对IL-27，IL-33，IFN-γ水平进行检测，在450 nm 波长下用酶标仪测各孔吸光度（A值），所有A值减去空白对照值后进行计算。以不同浓度的标准品A值作标准曲线，根据样品A值在标准曲线图上查出相应IL-27、IL-33、IFN-γ 含量。

1.2.2 荧光定量RT-PCR 检测血清中IL-27、IL-33 及IFN-γ 水平 对入选的各组受试者在治疗前、治疗后分别抽取5 ml 外周血，PBS 稀释后加入淋巴细胞分离液，Trizol 提取总RNA，反转录合成第一链cDNA。引物序列：IL-27/P28 正向引物5'-GAGCAGCTCCCT GATGTTTC-3'，反向引物 5'-AGCTGCATCCTCTCCAT GTT-3'，IL-27/EBI3 正向引物 5'-TGTTCTCCATGGCT CCCTAC-3'，反向引物5'-GCTCCCTGACGCTTGTAAC-3'；IL-33 正向引物 5'-AAATGAATCAGGTGACGGTG TT-3'，反向引物 5'-CCACAGAGTGTTCCTTGTTGTTG-3'；IFN-γ 正 向 引 物5'-GAGTGTGGAGACCATCAAGGA AG-3'，反向引物 5'-TGAGTTCATGTATTGCTTTGCG T-3'；内参照物β 肌动蛋白，正向引物5'-AGCGAGC ATCCCCCAAAGTT-3'，反向引物 5'-GGGCACGAAG GCTCATCATT-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。实验步骤参照SYBR green 荧光定量PCR 试剂盒说明书，PCR 反应体系为20 μl，反应条件：94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 个循环。重复3 次。

1.2.3 观察指标 观察3 组患者治疗前RPR 滴度水平，治疗前与治疗后IL-27、IL-33 与IFN-γ 水平，观察实时荧光定量PCR 检测3 组患者治疗前与治疗后IL-27、IL-33 与IFN-γ 水平，并分别比较3 组之间IL-27、IL-33 与IFN-γ 水平的差异性，并对其结果进行统计学分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 3 组患者年龄、性别、RPR 滴度的分析

3 组患者分别为25 例，其中男女性别比例血清转阴组为11:14；血清未转阴组为12:13；正常组为13:12，3 组之间性别比例差异均无统计学意义（P＞0.05）。治疗前血清转阴组与血清未转阴组其RPR 滴度在(1:4)、(1:8)、(1:16)、(1:32)的患者相应人数见表1，无统计学差异（P＞0.05）。

表1 正常对照组、梅毒血清转阴组、梅毒血清未转阴组临床资料（n,±s）

表1 正常对照组、梅毒血清转阴组、梅毒血清未转阴组临床资料（n,±s）

组别 例数 性别 治疗前RPR滴度 年龄(y)男 女 1:4 1:8 1:16 1:32血清转阴组 25 11 14 2 7 10 6 34.3±6.2血清未转阴组 25 12 13 1 9 11 4 35.8±5.6正常对照组 25 13 12 0 0 0 0 35.6±5.7 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

2.2 3 组患者治疗前后ELISA 检测IL-27、IL-33 及IFN-γ 水平

治疗前，3 组患者血清中IL-27 水平具有明显差异，梅毒血清转阴组、梅毒血清未转阴组中IL-27 水平明显高于正常对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），梅毒血清转阴组IL-27 水平高于梅毒血清未转阴组（P＜0.05）。治疗后，梅毒血清转阴组、梅毒血清未转阴组IL-27 水平仍显著高于正常对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），而二者之间在治疗后IL-27 水平差异无统计学意义（P＞0.05），梅毒血清转阴组在治疗前后，IL-27 水平无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05），梅毒血清未转阴者治疗后IL-27 水平高于治疗前，二者之间差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

治疗前，梅毒血清转阴组、梅毒血清未转阴组IL-33 水平明显高于正常对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），梅毒血清转阴组IL-33 水平与梅毒血清未转阴组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后，梅毒血清转阴组、梅毒血清未转阴组IL-33 水平高于正常对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），梅毒血清转阴组在治疗后，IL-33 水平较治疗前显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05），而梅毒血清未转阴组、正常对照组在治疗前后IL-33 水平无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

治疗前，3 组患者血清中IFN-γ 水平变化明显，梅毒血清转阴组、梅毒血清未转阴组患者中IFN-γ 水平明显高于正常对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），梅毒血清未转阴组IFN-γ 水平高于梅毒血清转阴组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。治疗后，梅毒血清未转阴组IFN-γ 水平高于正常对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），梅毒血清转阴组较正常对照组无明显变化。梅毒血清未转阴组在治疗前后，IFN-γ 水平明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 治疗前后3组患者IL-27、IL-33、IFN-γ水平ELISA检测结果 （¯x ±s，pg/ml）

2.3 治疗前后3 组患者实时荧光定量PCR 检测IL-27、IL-33 及IFN-γ 水平

治疗前后3 组患者IL-27、IL-33 及IFN-γ 表达水平详见表3。

表3 治疗前后3组患者IL-27、IL-33、IFN-γ 水平PCR检测比较 （¯x ±s，pg/ml）

3 讨论

梅毒是常见的性传播疾病之一，晚期常伴有系统损害，发病率成上升趋势。如若临床上能够做到早发现、早诊断、早治疗可极大预防或阻止晚期梅毒并发症的发生。有研究指出，在梅毒的发病机制中体液免疫和细胞免疫发挥相关作用，存在Th1/Th2 失衡现象[7]，宿主对梅毒螺旋体的免疫应答以Th1 细胞应答为主，Th1 细胞介导的迟发型超敏反应是机体清除梅毒螺旋体最主要的免疫应答反应[8,9]。

IL-27 主要由活化的单核细胞和单核细胞来源的树突状细胞产生，在T 淋巴细胞增殖分化的早期，可以活化T-bet 促进CD4+T 淋巴细胞向Th1 方向分化，同时亦可协同IL-12 促进初始T 淋巴细胞产生IFN-γ，进而促使Th0 细胞向Th1 细胞分化[10]。IL-33 属于IL-1 家族，是Th2 细胞活化因子，可促进Th2 细胞分泌IL-5、IL-13、IL-4 等细胞因子，IL-33 的分泌增加又对IFN-γ 等Th1 细胞因子的分泌产生抑制，最终使Th2 细胞的功能得到加强[11,12]。Th1 细胞分泌的细胞因子主要参与自身免疫反应性疾病及慢性感染性疾病当中，IFN-γ 是由Th1 细胞分泌产生，具有调控免疫应答，增强杀伤细胞活性的作用。而且IFN-γ 能够激活自然杀伤（NK）细胞、中性粒细胞、血管内皮细胞的活性来发挥免疫防御功能，增强机体的抗感染能力[13]。

从本实验研究ELISA 及PCR 实验结果可以看出，治疗前血清转阴组、血清未转阴组以及正常对照组IL-27 水平之间存在显著差异，其中以血清转阴组治疗前IL-27 水平最高，经过规则治疗后，血清转阴组IL-27 水平轻度增加，而血清未转阴组IL-27 水平显著增加，此结果表明梅毒患者治疗前体内IL-27 基础表达水平越高，患者血清梅毒特异抗体转阴概率越大，且ELISA 结果与PCR 结果相一致。研究表明，IL-27 具有抗炎特性[14]。本研究表明，IL-27 在清除梅毒螺旋体中起着重要作用，这与IL-27 的抗炎特性明显相关。

同时本研究结果显示，治疗前血清转阴组与血清未转阴组IL-33 水平之间无显著差异，但二者明显高于正常对照组，经过规则治疗后，血清转阴组其IL-33 水平显著下降，而血清未转阴组水平轻度下降，且ELISA 结果与PCR 结果相一致。对于血清转阴组，经过治疗后，其体内IL-33 水平显著降低，而对于血清非转阴组而言，治疗后IL-33 仍处于相对高水平状态，表明IL-33 不利于机体清除梅毒螺旋体，这可能与IL-33 促进了Th2 反应有关。

之前研究已证实IFN-γ 是由Th1 细胞分泌，而在梅毒患者体内，梅毒螺旋体能够抑制Th1 的产生。目前研究表明IFN-γ 具有多种生物活性，可以促进巨噬细胞杀伤病原微生物[15]。本实验研究ELISA 及PCR 实验结果表明，治疗前，血清转阴组、血清未转阴组以及正常对照组IFN-γ 之间存在显著差异，其中以血清未转阴组水平最高。通过正规驱梅毒治疗后，血清转阴组及血清未转阴组患者IFN-γ 水平均显著下降，ELISA 结果与PCR 结果相一致。这表明对于梅毒螺旋体患者，Th1 细胞分泌IFN-γ 来参与消除梅毒螺旋体，故通过监测梅毒患者治疗前后IFN-γ 水平，可以预测梅毒治疗敏感性及效果。有研究表明，IFN-γ 在早期梅毒患者血清中表达较高，伴随梅毒分期进展，其表达下降，提示免疫应答已由Th1 优势转为Th2 优势[16]，其机制有待进一步研究。