绿脓杆菌次级代谢产物的研究进展

孙玮玮

（天津大学 药物科学与技术学院，天津300072）

绿脓杆菌又称铜绿假单胞菌，是一种条件致病性革兰氏阴性菌，在自然界中分布广泛，存在于土壤，水，空气，人类以及各种动植物体内等。其产生的次级代谢产物种类繁多且往往表现出良好的生物活性，如对植物病原菌有抑制作用的吩嗪-1-羧酸，具有抗菌活性和群体感应能力的喹诺酮类化合物,能够帮助细菌吸收环境中Fe3+的铁载体，以及可作为表面活性剂的鼠李糖脂等化合物，引起了人们的广泛关注。本文综述了绿脓杆菌的形态特征，近些年来次级代谢产物的结构、生物活性及其在生物防治、环境治理等方面的应用，以期为绿脓杆菌的进一步开发和利用提供有效的参考价值。

1 形态学特征

绿脓杆菌是假单胞菌属的一种革兰式阴性菌，杆状，长约 1～5μm，宽 0.5～1.0μm。单在，成对或偶尔成短链。菌体有鞭毛，运动活泼。无芽胞，能形成荚膜，易被普通染料着染。生长温度为25～37℃，37℃为其最适宜温度，它在42℃下也能生长，帮助它区别于许多其他的假单胞菌物种。该细菌在普通培养基上易于生长，菌落呈圆形，光滑，微隆起，能产生绿脓素（蓝绿色）和荧光素（黄绿色），使得培养基带有蓝绿色荧光[1,2]。

2 绿脓杆菌次级代谢产物的分类

2.1 吩嗪类化合物（phenazines）

吩嗪是由绿脓杆菌分泌的一类通常具有特殊颜色的含氮三元杂环化合物。常见的由其产生的吩嗪类抗生素有绿脓菌素，吩嗪-1-羧酸,和吩嗪-1-甲酰胺。其中，人们对于绿脓菌素的研究最多。绿脓菌素（pyocyanin）是一种重要的细菌毒力因子，具有氧化还原能力，能接受或者贡献电子，帮助细菌在缺氧环境下生存，还可破坏宿主细胞的氧化还原平衡，导致细胞死亡，同时可作为信号分子调节绿脓杆菌的基因表达[3]。而由其产生的吩嗪-1-羧酸则表现出了高效广谱的抗菌活性。Zhou等人从一株水稻根际来源的绿脓杆菌PA1201中分离得到吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺，其能有效抑制水稻纹枯病菌和水稻白叶枯病菌的生长[4]。这些吩嗪类化合物的生物合成途径也被广泛研究，由分支酸（chorismic acid）开始，经过一系列蛋白PhzA-G的作用转换成吩嗪-1-羧酸，随后，经过各种酶的作用PhzH，PhzS和PhzM等，生成一系列不同的吩嗪类化合物[5]。

2.2 喹诺酮类化合物（quinolones）

绿脓杆菌能产生50多种喹诺酮类化合物，这一系列化合物的基本骨架为2位烷烃或烯烃链取代的4-喹诺酮或其N-羟基衍生物。这些化合物的结构有时候也以互变异构形式表示，称为4-羟基-2-烷基喹啉及其N-氧化物衍生物[5,6]。其中一些喹诺酮N-羟基衍生物往往表现出了良好的抗菌活性，如2-庚基-1-羟基4-喹诺酮被报到对金黄色葡萄球菌有适度的抑制作用，并且还能够通过抑制细胞色素b，阻断电子传递链，在琼脂板上选择代谢受损的小菌落变体[7]。除抗菌活性之外，2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮（PQS）和 2-庚基-4-喹诺酮（HHQ）还是十分重要的群体感应信号分子，能够调节细胞毒力因子的表达，影响细菌物质运输，在压力条件下还能够平衡细菌浓度。在生物合成途径上，这一系列的喹诺酮类化合物在多种基因调控下，由邻氨基苯甲酸和酮基脂肪酸缩合而成[8]。到如今，仍然有新的喹诺酮（喹啉）类化合物被不断从绿脓杆菌中分离出来，如Supong等人在2016年从水稻根部组织分离的一株绿脓杆菌BCC76810中得到了12个喹琳类化合物，包括4个在之前未被报道过的新化合物。这些化合物展现出了良好的抗菌，抗癌，抗疟疾以及抗氧化活性[9]。

2.3 铁载体（siderpores）

铁是生命的一种必须元素，它参与细胞的氧化还原反应，微生物也需要其合成生命活动所需要的细胞色素和酶等。但是大多数情况下，铁是以三价的形式存在，很难吸收利用。而绿脓杆菌能够分泌两种重要的铁载体叫做绿脓杆菌螯铁蛋白（Pyochelin）和铜绿假单胞菌铁载体（Pyoverdine），它们与铁离子有较高的络合能力，将环境中的铁离子运输到细胞内，再还原成二价铁以满足细菌生命活动的需要。在结构上，绿脓杆菌螯铁蛋白Pyochelin是一分子水杨酸和两分子的半胱氨酸的缩合产物[10]。铜绿假单胞菌铁载体Pyoverdine由3部分组成：一种荧光二羟基喹啉显色团，与显色团的氨基结合的酰基侧链(二羧酸或酰胺)，一种可变肽链通常由一个酰胺基连接到色团的C1（很少是C3）羧基上[11]。

2.4 藤黄绿脓菌素（Pyoluteorin）

藤黄绿脓菌素（Pyoluteorin），是由绿脓杆菌产生的一种聚酮类代谢物，最早是由Takeda在1958年从铜绿假单胞菌即绿脓杆菌T359和IFO3455分离得到的，结构上是由一个间苯二酚和一个二氯吡咯通过一个人羰基连接而成，能抑制多种细菌和真菌的生长，尤其对植物病原菌的抑制效果显著，对卵菌属真菌抑制性最强。终极腐霉可使许多寄主植物的幼苗枯萎和根基腐烂。Plt可抑制由终极腐霉引起的枯萎衰退[12]。

2.5 鼠李糖脂（rhamnolipids）

鼠李糖脂（rhamnolipids）是绿脓杆菌产生的一种可作为生物表面活性剂的次级代谢物,可用于各种环境污染修复，如烃污染，重金属污染和藻类污染，同时还有抑制植物病原菌，抗肿瘤等生物活性。它主要由两部分组成，分别为亲水基团的鼠李糖和疏水基团的不饱和脂肪酸[13]。Zhang等人从大庆油田油水采出液中筛选出一株产表面活性剂的绿脓杆菌QS-M2，其代谢产物经薄层层析和 HPLC-MS鉴定表明:主要的表面活性剂物质是鼠李糖脂类物质，其中单鼠李糖脂的主要组分为RhaC10C10、RhaC12C12，双糖脂的主要组分为 Rha2C14C12、Rha2C10C12和Rha2C10C10[14]。

2.6 其它

绿脓杆菌还能产生吲哚乙酸（IAA）和氢氰酸（HCN）类物质，Bano等人从土壤中分离出一株绿脓杆菌NJ-15,对植物病原菌尖孢镰刀菌，烟草赤星病菌，苗木茎腐病菌有较好的抑制作用。该菌株在含有色氨酸的培养基上培养时能产生大量的吲哚乙酸，用chrome azurol S和King's B培养基培养能同时产生氢氰酸和铁蛋白。吲哚乙酸能促进植株的生长，而氢氰酸则能病原菌细胞色素c氧化酶的活性，阻断呼吸电子传递链，有助于抑制各种植物病原菌[15]。

N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）也是一类能够调节群体行为的生物信号分子。结构上，它们是由不同长度和取代位置的脂肪酸通过肽键连接到高丝酸内酯上。绿脓杆菌能分泌两类AHLs,分别为N-3-oxo-dodecanoyl homoserine lactone（3-oxoC12-HSL）和 N-butanoyl homoserine lactone（C4-HSL）。一些含量较低的其他AHLs也可从绿脓杆菌的上清液中检测到，如3-oxo-C14-HSL and 3-oxo-C10-HSL[16]。

绿脓杆菌可产生多种酶类化合物，如Ren等人发现一株土壤来源的绿脓杆菌CS-2能分泌一种有机溶剂耐受性胞外脂肪酶，这些酶可催化水解一些水不溶性酯类化合物，是工业酶制剂研究的重要组成部分[17]。Gupta等人发现，绿脓杆菌GRC1能分泌一种胞外几丁质酶，能抑制引起花生茎叶病的核盘菌，可开发为生物控制剂，用来防治植物病害[18]。Nagafi等人从绿脓杆菌PD100中分离得到了一种蛋白质酶，该酶可在溶剂存在下降解蛋白，其在废物处理应用，洗涤剂和皮革工业方面具有潜在的应用价值[19]。

绿脓杆菌还能产生另外一类毒力因子叫做外源凝集素（lectins）。Imbetry等人报道了两类由绿脓杆菌产生的外源性凝集素PAIL和PAIIL。它们作为疫苗使用，注射到小鼠体内后，可充分提供保护使其免受绿脓杆菌的感染。这些凝集素的另一个有前途的用途是，它们可用于筛选聚糖，这些聚糖可能与病原体对宿主细胞的粘附有效竞争，从而有助于调解微生物对抗生素耐药性增加的问题。且研究表明，PA-IL和PA-IIL都是具有这种潜力的天然聚糖的非常有用的探针[20]。

3 应用前景研究

3.1 生物防治植物病害

绿脓杆菌所产生的物质活性多样，应用前景十分广阔，尤其在生物防治农业病害方面。Shi等人从番木瓜果皮内筛选出一株铜绿假单胞菌MGP3，该菌株对10种病原菌有较强的拮抗作用，尤其对炭疽病和疫霉病有良好的治疗效果，具有潜在的生防应用价值[21]。Yang等人从受感染的玉米叶中分离出一株绿脓杆菌CB-4，具有高效的除草活性，对Digitariasanguinalis展示了十分强大的抑制作用，其刺激代谢物可进一步用于开发为生物除草剂[22]。Ren等人才从一株水稻上分离出绿脓杆菌ZJ1999,其对水稻纹枯病具有较强拮抗作用[23]。

3.2 治理污染

铜绿假单胞菌和许多其他假单胞菌一样可以降解芳香烃，如甲基苯，一种被认为是存在于大气、地下和土壤以及地表水中的环境污染物。铜绿假单胞菌通过将甲基氧化为醛、醇和酸来降解甲苯，然后将其转化为儿茶酚[24]。因此，铜绿假单胞菌可用于污染控制。Huang等人从矿井周围溢油污染土样中筛得两株绿脓杆菌，分别命名为绿脓杆菌WB2以及SA1，通过摇瓶降解实验发现这两株菌具有协同降油能力，对石油污染土壤具有修复作用[25]。另一株铜绿假单胞菌NY3的胞外分泌物对烃类具有降解作用，可用于治理烃类污染，进一步研究发现，其胞外小分子活性物主要是吩嗪类和异咯嗪类化合物，这些小分子活性物具有氧化还原反应活性，可以加快电子传递速度，从而促进NY3菌代谢烃的效率[26]。

4 结论与展望

绿脓杆菌是一种临床上较为常见的致病菌，但其产生的次级代谢物结构多样，生物活性丰富，在植物病害防治，治理污染以及用作表面活性剂方面等都具有重要的应用价值。目前，由于微生物发酵获得的次级代谢产物含量较低，而通过生物合成和化学合成次级产物难度较大，很多技术还不成熟，这成为日后需要解决的一个问题。随着近年来生物合成，基因组学，分离技术和仪器的不断发展，相信在不久的将来，微生物次级代谢产物一定会得到更好地利用。