耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌毒力基因检测及药敏分析

邹佳贺,刘效伊,席健峰，徐 义,王 勇*

(1.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003；2.深圳市龙岗区妇幼保健院，广东 深圳 518172；3.云台山风景名胜区云台街道卫生院，江苏 连云港 222000)

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)属于革兰氏阴性杆菌，近年来已成为引起社区获得性感染和医院感染最重要的病原菌之一，可导致呼吸道、泌尿道、伤口等部位的感染及败血症、肝脓肿等疾病。碳青霉烯类抗菌药物是活性最强、抗菌谱最广的非典型β-内酰胺类抗菌药物，常被认为是治疗革兰阴性杆菌引起感染的最后一道防线[1]。近年来，由于碳青霉烯类抗菌药物的大量使用，导致了耐碳青霉烯类肠杆菌的出现(CRE)。收集2018年6月到2019年6月我院分离出的CRKP菌株42株,检测其毒力基因并对其药敏结果进行分析。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

收集2018年6月至2019年6月佳木斯大学附属第一医院从患者标本中分离出的CRE菌株，去除同一患者不同部位相同的菌株共41株。

1.2 仪器与试剂

Vitek-2 Compact全自动微生物分析仪(法国梅里埃公司)。血平板、麦康凯平板(OXOID公司)。

1.3 标准质控菌株

肺炎克雷伯菌ATCC700603购自国家卫生计生委临床检验中心。

1.4 拉丝试验

CRE菌株接种在含5%羊血琼脂平板上，培养18～20h，然后用接种针轻轻挑起菌落，如果挑起菌落过程中出现丝状物并且≥5mm，则为拉丝试验阳性；反之，丝状物长度<5cm则为阴性[2]。

1.5 PCR检测毒力基因

用磁珠法提取细菌的模板DNA，根据文献[3-5]委托上海生工生物技术公司合成毒力基因magA、uge、kfu、allS、iroNB、mrkD、kpn、fimH，阳性产物送上海生工生物有限公司测序，结果在NCBI网站上运用BLAST比对确定其基因型(表1)。

表1 毒力相关基因引物序列

表1(续)

1.6 统计分析

数据使用SPSS 22.0 ，Fisher精确检验进行统计分析，计数资料采用X2检验,以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRKP的临床科室分布

42株CRKP中有32(76.2%)株是ESBL阳性菌，10(23.8%)株是ESBL阴性的菌。ESBL阳性菌主要见于重症医学科和神经外科，ESBL阴性菌主要见于重症医学科，见表2。

表2 ESBL阳性菌和ESBL阴性菌科室分布

2.2 CRKP拉丝试验结果

对佳木斯大学附属第一医院42株CRKP进行拉丝实验，结果皆为阴性。

2.3 CRKP毒力基因携带情况

(M：表示mark 1、泳道是uge 2、泳道是fimH 3、泳道是mrkD 4泳道是kpn)

使用PCR方法检测我院42株CRKP，结果42株CRKP经PCR检测fimH携带率为88.1%(37/42)，mrkD携带率为92.9%(39/42)，kpn携带率为92.9%(39/42)；所有菌株均携带uge基因；magA,kfu,iroNB，alls均未检出，见图1。

2.4 CRKP药敏结果

42株CRKP对临常用的抑菌药物如阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦、头孢呋新、头孢呋辛酯、头孢西丁、头孢他啶、头孢曲松、头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟、厄他培南、亚胺培南、左旋氧氟沙星、复方新诺明等耐药性显著。对阿米卡星敏感性达100%。以下是 ESBL阳性CRKP菌株和ESBL阴性菌株耐药情况，见表3。

表3 ESBL阳性CRKP菌株和ESBL阴性菌株耐药结果

表3(续)

3 讨论

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯杆菌(carbapenem-resistantenterobacteriaceae，CRKP)是一种对头孢菌素类、青霉素类甚至是碳青霉烯类抗生素广泛耐药的多重耐药菌，目前CRKP仅对替加环素、多粘菌素敏感。研究表明SARS死亡率为11%，而CRKP感染患者死亡率可达40%～50%[6]，感染CRKP的血液病患者死亡率甚至高达60%以上[7]，被称为超级耐药菌。由于替加环素在国内还未上市，多粘菌素有很强的毒副作用，应用范围狭窄，CRKP已处于无药可治状态。中国细菌耐药性监测(CHINT)发布报告指出KP对亚胺培南的耐药率由2005年的3%，到2010年的9.2%，再到2016年16.1%，可以看出CRKP成明显增长趋势，且不同地区细菌耐药情况存在差异[8]。由于本地区医院尚未使用阿米卡星这种抗菌药物，所以对阿米卡星敏感性达到100%。肠杆菌科细菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要耐药机制之一是产生超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases，ESBLs)。ESBLs能水解青霉素类、头孢菌素(包含第三代、第四代头孢菌素)及单环酰胺类，如氨曲南，并且可以被β-内酰胺酶抑制剂抑制的由质粒介导的一类β-内酰胺酶。ESBLs主要见于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，也见于肠杆菌属、变形杆菌属、枸橼酸杆菌属、沙雷菌属等其他肠杆菌科细菌。近年随着抗菌药物大量使用，特别是第三代头孢菌素的广泛使用往往是促使产ESBLs菌株出现及广泛播散的主要原因，各种肠杆菌科细菌甚至都出现了对碳青霉烯耐药的菌株，表现出多重耐药。多重耐药形成的机制比较复杂，主要与产生ESBLs、AmpC酶、碳青霉烯酶等各种重要的灭活酶以及细菌外排系统过度表达、膜通透性改变等机制有关。它们常因携带多种不同的耐药基因而具有多重耐药性，这种耐药性可以通过质粒、转座子等可移动元件在细菌的种内或是种间传播，造成感染爆发流行，控制产酶菌株的流行防止耐药菌谱近一步扩大，已经成为减缓耐药菌众多措施中的重中之重。

CRKP存在高致死率，但它们的毒力因子特征还尚不清楚。Ⅰ型和Ⅲ型菌毛被认为与KP的粘附有关，是另一类较为重要的毒力基因。Ⅰ型菌毛是细菌表面上的线状突起，由fimA-H基因编码。Ⅲ型菌毛是螺旋状的细丝，在KP中由mrkABCD基因簇编码。有研究显示，KP利用环境因素来调节Ⅰ型菌毛的表达，Ⅰ型菌毛在泌尿道中表达，但不在胃肠道或肺中表达，有助于编码Ⅰ型菌毛的hvKP在泌尿道的粘附，引起尿道炎和膀胱[9]。Hornick称Ⅲ型菌毛可以通过mrkD基因介导体外物质与气管、口腔细胞和肺组织结合[10]，这与呼吸机相关性肺炎分离的标本中均能检出mrkD基因有关。有研究称无论是hvKP还是cKP都存在Ⅰ型和Ⅲ型菌毛，但也有mrkD基因只在hvKP中检出，并与K2血清型密切相关的报道[11]。究竟编码Ⅰ型和Ⅲ型菌毛的基因是否在特定的KP中检出，需要进一步的研究。根据毒力基因携带情况可知我院的CRKP毒力基因目前只发现了四种。

4 结论

综上所述，应该更加注重对CRKP的耐药性和毒力基因的检测，从而促使临床医生更好的认识和了解CRKP。