不同产前诊断指征的羊水细胞染色体核型分析

陈竞茜 揭秋玲 龙平 钟高布 孙超 卢惠 王樱瑾王军 马燕琳，4

1海南医学院第一附属医院海南省人类生殖与遗传重点实验室（海南医学院第一附属医院生殖医学科/海南省地方病（地中海贫血）临床医学研究中心/海口市人类遗传资源保藏重点实验室）（海口570102）；2南方医科大学南方医院妇产科（广州510515）；3德克萨斯州心脏研究中心（休斯顿德克萨斯州77030）；4海南医学院热带转化医学教育部重点实验室（海口571199）；

染色体病是常见的遗传病，占新生儿疾病的0.7%［1］，2006年全球出生缺陷报告显示，染色体病主要以21 三体综合征、18 三体综合征、13 三体综合征为主，占出生缺陷的6.9%［2］。2017年一项基于人群的出生缺陷研究发现，遗传因素包括染色体异常所致的出生缺陷约19.07%［3］。目前该病尚无有效的治疗方法，只能是对高危人群进行产前诊断来检测该类疾病，预防该类患儿的出生。产前诊断包括有创性产前诊断及无创性产前诊断，由于技术及准确性等多方面考虑，目前较常用的产前诊断为羊膜腔穿刺术，目前其产前诊断的指征主要有：胎儿染色体非整倍体无创产前基因检测（non-invasive prenatal testing，NIPT）高风险，B 超胎儿多发畸形，血清学筛查（唐氏筛查）高风险，父母染色体异常，高龄，不良孕产史和地贫携带［4-6］。为提高我国的出生人口素质，临床上主要用经典的筛查方法：血清学筛查来评估染色体病的发生风险率，阳性病例进一步行产前诊断。随着产前检查技术的飞速发展，近年通过NIPT 进行唐氏筛查得到了广泛应用［7］。随着超声医学的飞速发展，胎儿的超声软指标的筛查也应用于产前诊断中。另外随着我国二孩政策的实施，许多高龄孕妇增加，因年龄因素的胎儿患染色体病的概率也明显增加，因此，高龄妊娠也成为产前诊断的一个重要指征。海南地区是地中海贫血（thalassemia，简称地贫）高发区域，夫妇双方如为地贫携带者需行羊膜腔穿刺术取羊水细胞以检测胎儿的地贫基因型，防止地贫患儿的出生，同时检测羊水细胞的染色体核型。本文总结了不同产前诊断指征，在我中心行羊水细胞培养的3 251 例孕妇的羊水细胞染色体核型结果，探讨胎儿染色体异常核型与产前诊断指征的关系，为产前筛查及诊断提供参考，同时对提高染色体异常的检出率，对进一步提高产前诊断的效率具有非常重要的意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2013年3月至2016年12月，在我中心遗传咨询门诊进行遗传咨询并经羊膜腔穿刺术进行产前诊断的孕妇3 251 例，年龄19 ～45岁，孕周16 ～31周，产前诊断指征包括NIPT高风险、B 超胎儿多发畸形、唐氏血清学筛查高风险、父母染色体异常、高龄、不良孕产史、地贫基因携带。

1.2 方法 在告知孕妇本人及家属行羊膜腔穿刺术及羊水细胞染色体核型分析的风险及产前诊断范围，孕妇及家属签署知情同意书后在B 超引导下，行羊膜腔穿刺术，抽取羊水20 mL，分装于两支15 mL 离心管，1 500 r/min，离心5 min 后弃上清，留取约0.5 mL 制成细胞悬液，按照两线培养原则，分别无菌接种于两个4.5 mL 羊水培养基的25 cm3培养瓶中，并分别平铺混匀。置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养7 d，倒置显微镜下观察羊水细胞贴壁生长情况，当羊水细胞贴壁生长旺盛，并且有3 个以上大克隆，或者7 个以上中克隆，细胞呈圆亮时，便进行传代处理，使细胞重新分布于4 个培养瓶里继续培养2 ～3 d 后，当传代细胞融合率达到70%～80%时，进行两线细胞收获、制片，常规染色体G 显带，用德国蔡司全自动染色体扫描分析系统进行核型分析，计数20 个分裂相，分析3 个核型，异常核型增加计数，分析量，发现嵌合体至少计数100 个分裂相，并收获第3 瓶细胞再次进行染色体分析；对于染色体结构异常的核型，建议行父母染色体核型分析，诊断标准按照人类细胞遗传学国际命名（ISCN2013）标准进行。

1.3 统计学方法 运用SPSS 22.0 统计软件，卡方检验分析各产前诊断指征与产前诊断结局的关系，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 染色体异常核型在不同产前诊断指征中的检出情况 3 251 例产前诊断的羊水标本中共检出染色体异常核型182 例，染色体异常核型检出率为5.60%。不同产前诊断指征的染色体异常核型检出率不相同，NIPT 高风险的羊水细胞染色体异常核型检出率最高，为83.84%，详细检出情况见表1。

表1 不同产前诊断指征的羊水细胞染色体异常核型检出情况Tab.1 The diagnosis results of abnormal karyotype of different indication of antenatal diagnosis例

2.2 染色体异常核型分布情况 182 例染色体异常核型中常染色体数目异常130 例，性染色体数目异常8 例，平衡性结构异常28 例，非平衡性结构异常4 例，嵌合体10 例，倒位2 例。染色体的多态性如9 号染色体的臂间倒位，D/G 组随体及短臂多态变异以及縊痕区的多态变化，在本文中不作讨论。染色体异常核型详细分布情况见表2。

表2 羊水细胞染色体异常核型分布情况Tab.2 The distribution of chromosomal abnormal karyotype of antenatal diagnosis（n=182） 例

2.3 不同产前诊断指征染色体异常核型差异情况 染色体异常核型组182 例，染色体正常核型组3 069 例。产前诊断指征中，染色体异常组和染色正常组中NIPT 是否为高风险，B 超胎儿是否多发畸形，唐氏筛查是否高风险，父母染色体是否异常，孕妇是否高龄及是否地贫基因携带比较，其染色体异常检出率差异具有统计学意义（P＜0.05）；而是否具有不良孕产史比较，其染色体异常检出率差异不具有统计学意义（P=0.581）。见表3。

2.4 NIPT产前筛查优于血清学筛查 NIPT对T21具有较高的准确性，对T18 以及T13 仍存在较大的假阳性率。本文统计了89 例T21，T18，T13 的孕妇无创性NIPT 检测以及相应的有创性羊水产前诊断结果对比，见表4。

表3 不同产前诊断指征染色体异常核型的差异Tab.3 The difference chromosomal abnormal karyotype in different indication of antenatal diagnosis 例（%）

表4 89 例孕妇无创NIPT 三体高风险与羊水细胞染色体诊断结果Tab.4 89 cases maternal NIPT′s trisomy high risk and antenatal diagnosis results 例

3 讨论

3.1 针对性的产前诊断可以提高染色体异常的检出率 染色体核型异常可导致染色体病，是常见的遗传性疾病之一，目前仍无有效的治疗方法，只能联合应用多种筛查及诊断方法互相补充诊断染色体病，从而减少该类遗传性疾病患儿的出生。针对不同产前诊断指征，如NIPT 高风险，B 超胎儿多发畸形，唐氏筛查高风险，父母染色体异常，高龄，不良孕产史等进行产前诊断是可以减少染色体病儿出生。本文回顾性地分析了3 251 例羊水标本，发现染色体异常核型182 例，异常检出率为5.60%（182/3 251），与近几年国内其他地区文献报道的检出率相似，为5.93%～8.10%［8-9］。各地区报道的染色体核型异常检出率具有细微差别，可能是由于纳入分析的人群中产前诊断比例的不同以及各地区人群染色体异常的特异性所致。有针对性的产前诊断可以有效地诊断染色体病，降低遗传性疾病缺陷儿的出生，产前诊断指征的严格把控，对提高染色体异常检出率，进一步提高产前诊断的效率具有重要意义。

3.2 NIPT 假阳性率 NIPT 检测作为一种较新的非介入的较高准确性的产前筛查技术，该技术与传统的唐氏筛查相比较，NIPT 对T21 有较高的准确性。对于筛查为高危的孕妇，该检查可以增加染色体阳性检出率，减少漏检，可有效地降低穿刺检查的数量。该技术接近于羊水胎儿染色体核型分析技术，具有高敏感性，高特异性，早期检测，无创安全，其用时少，风险小，取材简单，不管是从心理和生理层面均减少了孕妇的痛苦及减少了大量不必要的有创性产前诊断等优势，较大程度地优化了产前诊断流程，改善了产前诊断服务模式，正被越来越多的孕妇及家属认可［10-12］。但NIPT 仍具有一定的局限性，该技术条件要求较高，对染色体的数目异常及嵌合体，易位等结构异常仍无法检测，出现假阳性及假阴性［13-14］，其中T21 假阳性率最低，为0.09%，T18 假阳性率为0.19%；T13 假阳性率最高为0.22%。既往研究中，ZHANG 等［7］纳入112 669 例病例分析NIPT 检测T21 的假阳性率为0.05%，T18 的假阳性率为0.045%，T13 的假阳性率为0.04%。同时GRATI 等［15］纳入3 222 例病例分析NIPT 检测T21 的假阳性率为0.097%。假阳性结果与本研究中T21、T18 与T13 的假阳性率接近。同时NIPT 不适宜检测多胎妊娠［16］，因此NIPT 仍未能替代传统的筛查方法及产前诊断。因无国家食品药品监督总局认证，本实验室尚无开展基因芯片技术及二代测序技术，只能依靠比较初级的检测来提高产前诊断异常核型的检出率。

3.3 不同产前诊断指征中染色体三体异常率最高 本研究发现的染色体异常核型中，以染色体三体异常率最高，为138 例，占所有异常核型75.8%（138/182），其中以21三体为主（95例），其占三体异常的68.8%（95/138），与文献［5，17］报道基本一致。本研究的7 种产前诊断指征均与胎儿染色体异常密切相关。NIPT 高风险的检出率最高，为83.84%，99例NIPT高风险中，羊水检测54例为T21，16 例为T18，3 例为T13，5 例为性染色体异常，3 例为嵌合体，2 例为其他染色体异常。在3 251 例孕妇中，因唐筛高风险而进行羊水产前诊断的有1 866 例，共检出30 例异常核型，异常率为1.61%，23 例T21，1 例T18，2 例易位染色体核型，4 例嵌合体。由此可见唐筛不仅能检出T21，T18，也能检出其他异常的染色体。B 超检测出的胎儿异常包括羊水过多或过少，肾积水，胎儿颈项透明层增厚，双侧（单侧）脉络丛囊肿，侧脑室囊性水肿，胎儿水肿，胎儿心室内强回声点等各种胎儿畸形均可能与染色体有关［18-20］，B 超筛查是检测胎儿遗传病的重要手段。本文研究的B 超胎儿多发畸形的异常核型检出率为8.96%，其中检出8 例T18，4 例T21，2 例T13，1 例嵌合体，1 例其他染色体异常，18 三体在中孕时会出现多发畸形的各种结构异常，B 超筛查对18 三体的敏感性较高，现在B 超作为一种无创伤性的产前诊断指征已受到关注。

3.4 高龄孕妇，夫妇染色体异常等更应重视产前诊断 随着我国计划生育政策的放宽，欲生二孩的高龄孕妇越来越多。本研究中高龄孕妇的染色体异常检出率为3.76%，远远高于唐筛的异常检出率1.61%，也远远高于新生儿染色体异常率0.7%。母亲高龄是形成“三体”病的原因之一。因为随着年龄的增加，女性的卵原细胞受外界的影响因素越来越多，卵巢功能开始退化，导致配子的易发畸形，胎儿易患染色体异常的概率增加［21］。随着年龄的增加，染色体数目及结构异常发生率显著增加，如21-三体，18-三体及13-三体［22-25］。我国的《母婴保健法实施办法》也规定，对高龄孕妇直接进行羊膜腔穿刺术的产前诊断。因此，对于高龄孕妇，更应该重视产前诊断，对胎儿染色体进行检查，及时发现异常，预防染色体病儿的出生。

夫妇染色体异常是仅次于NIPT 异常核型检出率最高的一组。当在临床羊水标本中发现结构异常的染色体核型时，为了判断该异常核型的来源均建议其双亲行外周血染色体核型分析。虽然大部分检出的异常核型来源于父母的平衡性易位，可以发育至正常分娩，但少数异常胎儿的检出仍需羊水穿刺来检查。YU等［26］研究发现具有不良孕产史夫妇的胎儿染色体异常率为7.4%，本研究中异常检出率为3.28%，均较新生儿染色体异常率0.7%明显增高。因此，不良孕产史也是羊水产前诊断高危指征之一。

3.5 加强海南地区产前筛查与产前诊断的宣教尤为重要 海南省是我国地贫基因携带、患病的流行的区之一。我省对可能生育的地贫儿或已生育地贫儿的家庭给予产前免费检查，并且对这部分孕妇在进行羊膜腔穿刺术取羊水进行胎儿地贫基因检测的同时也进行胎儿细胞培养及核型分析。因海南地区偏远、少数民族较多，这部分患者的产前检查意识较低，且大部分患者来自乡镇，几乎不做产前筛查。本文研究了421 例因地贫携带来行产前诊断的孕妇，同时进行细胞染色体核型分析，减少地贫产前诊断中遗漏染色体异常病例。本研究中共发现10 例异常核型，异常核型率为2.38%，低于整体人群，与韦世录等［27］的研究结果一致。以上数据提示，在防治地贫的同时，也要减少染色体异常患儿的出生，有针对性的产前诊断可以提高胎儿染色体异常的检出率，对提高我国人口优生很有社会效益。

综上所述，结合NIPT 高风险，B 超异常，唐筛高风险，父母染色体异常，高龄等各种产前诊断指征来进行羊水染色体检查，以确诊胎儿染色体核型，并对可能妊娠异常染色体胎儿的夫妇进行遗传咨询，可以明显提高染色体异常的检出率，减少染色体异常儿的出生率，从优生的角度提高我国出生人口的身体素质具有重大意义。