柔嫩艾美耳球虫入侵对MDBK细胞NF-κB表达的影响

王黎霞，邓家俭，张建军，安 健

(1.北京农业职业学院畜牧兽医系，北京 房山 102442；2.北京农学院动物科学技术学院，北京 昌平 102206)

细胞凋亡是具有确定的形态学变化的细胞死亡的一种方式。细胞内寄生虫，如微小隐孢子虫、小泰勒虫、鼠弓形虫、疟原虫和球虫等，能够干预宿主细胞的生命活动，入侵宿主细胞后均可抑制宿主细胞凋亡[1]。Lang M等证实，牛柔嫩艾美耳球虫子孢子感染VERO和BFGC细胞可抑制由放线菌素D和细胞松弛素B诱导的凋亡，其试验结果显示，牛艾美耳球虫通过表达细胞内凋亡抑制蛋白1(c-IAP1)和Fas相关性死亡结构域蛋白样白介素转变酶抑制蛋白(c-FLIP)来阻止宿主细胞凋亡[2]。据报道，核转录因子(NF-κB)的表达也会引起凋亡抑制，NF-κB最初在鼠成熟B细胞和粒细胞瘤中发现，命名为细胞核Kappa轻链基因表达的调节子，研究发现其存在于多种细胞中。NF-κB通过参与多个目的基因的转录来调节细胞增殖、分化和生长，尤其与细胞凋亡有很大关系。Cacho E等利用鸡活体进行试验，发现毒害艾美耳球虫感染宿主细胞后，在第2代裂殖体的成熟的过程中，表达了抑制寄生虫诱导凋亡的转录因子NF-κB和下游的抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达，而且还表达了磷酸化的NF-κB(p-IκBα)，作者认为毒害艾美耳球虫先诱导激活NF-κB，保护了带虫细胞免于凋亡，使第2代裂殖子得以成熟[3]。Kim J Y等证实，刚第弓形虫感染小鼠脾细胞后，导致NF-κB的激活，抑制了由放线菌素D诱导的凋亡[4]。还有试验证明，宿主细胞缺失NF-κB p65亚基后，就丧失了感染引起的凋亡抑制作用，说明虫体引起了NF-κB的调节和磷酸化的IκB在纳虫泡膜上的聚集定位[5]。我们在E.tenella子孢子入侵体外培养MDBK细胞后，用终浓度6%乙醇进行凋亡诱导，通过Annexin V/PI双荧光染色法和流式细胞术(FCM)对MDBK细胞的凋亡水平进行检测，发现MDBK细胞的凋亡受抑，而E.tenella子孢子入侵MDBK细胞后宿主细胞的凋亡是否与NF-κB的表达有关未见报道，因此，本试验用免疫细胞化学技术探讨E.tenella子孢子入侵MDBK细胞后宿主细胞的NF-κB的表达，明确E.tenella子孢子入侵MDBK细胞后宿主细胞的凋亡是否与NF-κB的表达有关系。

1 材料与方法

1.1 细胞株和寄生虫 MDBK细胞株，由中国农业大学动物医学院索勋教授馈赠；柔嫩艾美耳球虫河北株，由北京农学院实验室保存，每半年用7日龄雏鸡传代保存活力，试验用卵囊为新鲜卵囊 (1个月内)。

1.2 药品与试剂 DMEM细胞培养基和胎牛血清，购自Gibco公司；胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)，购自Solarbio公司；小鼠抗NF-κB抗体，购自BT公司；山羊抗小鼠IgG抗体、DAB显色试剂盒，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Triton X-100、多聚赖氨酸，均购自Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 子孢子纯化、入侵凋亡诱导、凋亡鉴定 子孢子的分离和纯化采用过 DE-52层析柱的方法[6]，柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵、细胞凋亡诱导、凋亡检测采用流式细胞术和Annexin V/PI染色法[7]。

1.3.2 受侵细胞中NF-κB的检测 用PBS漂洗盖玻片3次，2 min/次；4%多聚甲醛处理(室温)20 min；PBS漂洗盖玻片3次，2 min/次；0.5%Triton X-100处理(室温)20 min；PBS漂洗盖玻片3次，2 min/次；3%H2O2(二抗试剂盒自带)处理(室温)10 min，以消除内源性过氧化物酶活性；PBS漂洗(浸泡)盖玻片3次，2 min/次；滴加一抗(1∶100)(PBS稀释)，阴性对照用PBS代替一抗，37 ℃ 1～2 h或4 ℃过夜；4 ℃过夜和从冰箱拿出后37 ℃复温45 min；PBS漂洗(浸泡)盖玻片3次，2 min/次；滴加二抗，山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体，37 ℃孵育30 min；PBS漂洗(浸泡)盖玻片3次，2 min/次；DAB显色，自来水漂洗10次，3 min/次；封片剂封片(有细胞一面对着载玻片)，荧光倒置显微镜观察。

结果判定：镜下抗原阳性信号呈现棕红色或棕黄色颗粒或团块状。

2 结果

细胞免疫组化结果表明，在入侵有球虫子孢子的MDBK细胞细胞核边缘有棕黄色阳性物质(见中插彩版图1A，白箭头)，阴性对照组(见中插彩版图1C)为未感染球虫子孢子组，MDBK细胞在凋亡诱导后细胞核中无棕黄色阳性物质。说明6%乙醇诱导凋亡时，带虫细胞可以活化核转录因子NF-κB。

3 讨论

试验结果显示，未感染诱导凋亡对照组，细胞无染色，细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，核质浓缩，细胞核固缩(见中插彩版图1C)。感染诱导凋亡组，入侵有子孢子的MDBK细胞，细胞大小正常，入侵有球虫子孢子的MDBK细胞细胞核边缘带有棕黄色阳性物质(见中插彩版图1A)，说明带虫细胞可以促进核转录因子NF-κB的表达，其抑制凋亡的机理可能与NF-κB的表达上调有关。

NF-κB是由p50和p65两个亚单位组成的二聚体，未被激活时位于胞浆，并和IκB 结合在一起，在某些刺激因素作用下，IκB被磷酸化及降解，NF-κB被快速转运至核内，与特定基因的启动子或增强子上的相应位点结合，从而调节基因转录。因此，核因子NF-κB的表达能够直观的反映出NF-κB转位及活化[8-9]。

胞内寄生虫感染后，宿主可通过一种独特方式达到杀伤、消灭寄生虫的作用，即促使已感染寄生虫的自身细胞的凋亡，但事实上，寄生虫往往可逃避宿主直接的免疫杀伤作用，其通过干扰宿主细胞的凋亡过程、抑制宿主细胞的凋亡来实现，以有利于自身的生存，达到免疫逃避作用。目前的研究发现，转录因子-核转录因子(NF-κB)家族能够调节凋亡抑制分子的转录。

在其他顶复门寄生虫中，弓形虫通过阻断不同的凋亡前信号级联放大来抑制受感染细胞的凋亡，包括JNK通路和NF-κB通路，从遗传学来看，弓形虫属与艾美耳属在遗传上十分相近[10]，且JNK通路与NF-κB通路可以相互调节，JNK的磷酸化可调节下游的NF-κB[11]，氧化应激、细菌脂多糖、细胞因子等多种刺激可活化MAPK-NF-κB 这条通路[12-13]，能调控炎症性细胞因子、细胞表面受体、转录因子、粘附分子等的生成。Cacho E等[3]推测子孢子的某些成分或刺激细胞产生的某些成分通过刺激IκB发生磷酸化，使p65/p50异源二聚体与IκB分离，最终调控产生Bcl-xL。Bcl-xL通过与Bax形成异源二聚体，但是对于Bcl-2家族抑制细胞凋亡的机制尚不清楚。李捷萌等认为，Bcl-2蛋白主要是通过抑制钙离子的释放，阻止各种凋亡刺激因素引起的线粒体膜通透性的增加，从而阻止线粒体释放细胞色素C，抑制凋亡级联反应从而抑制细胞凋亡[14]。在核因子通路中，下游信号已有相关报道，而上游信号在艾美耳属球虫中依然未知。目前弓形虫凋亡关系研究主要集中于JNK通路，而堆型艾美耳球虫曾有报道存在丝氨酸蛋白酶抑制剂，这与抑制细胞凋亡相关[15]，主要抑制caspase的活性，而NF-κB通路中依赖caspase的通路几乎没有，而JNK通路的激活却和caspase有很大关系，牛艾美耳球虫研究中发现，c-FLIP能够影响Fas的表达[2]，而且弓形虫的抑制凋亡通路也与这个通路有关。而且该通路的受体TNFR1也是NF-κB的重要受体，它可连接TRADD，TRADD再与2个TRAF2/5连接，2个TRAF2/5再连接RIP1，刺激核因子通路。由此推断柔嫩艾美耳球虫感染时，抑制凋亡的通路也可能是该通路。

细胞免疫组织化学试验过程中，选择爬片，是为了细胞贴壁效果好，节省一抗，还可用树酯固定，便于短时间的保存，比用24孔板中直接做要好。在选择一抗的浓度过程中，最终确定1∶100的效果最好，一抗可重复利用。在DAB染色后，如果在自来水下冲，这样容易使细胞脱落，我们选择漂洗的方法，多洗几次，并不断在镜下观察颜色的变化，以便获得较好的图片效果。