生殖道病原体核酸检测试剂分析性能评估的要点

国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心 （北京 100081）

内容提要： 探讨了生殖道病原体核酸检测试剂分析性能评估的要点，阐述了产品临床前研究需要重点考虑的因素。并以高危型人乳头瘤病毒检测试剂以及沙眼衣原体和/或淋病奈瑟菌检测试剂为例进行了说明，包括企业参考品的设置等。

泌尿生殖道感染是全球性的社会及公共卫生问题。致病性病原体感染是多种生殖系统疾病的源头，可引起生殖系统炎症、不孕症、淋病以及新生儿感染，还可增加宫颈癌的发生风险等。生殖道感染性疾病诊断方法不规范、结果不准确将会导致患者无法得到及时治疗或者过度治疗。随着核酸检测技术的发展，近年来分子诊断产品层出不穷，包括多种生殖道病原体单项或者联合检测的产品；并且逐渐成为生殖道感染性疾病诊断的主要手段之一。

比如支原体是一种条件致病微生物，有较高的生殖道携带率，现已证实生殖支原体是女性宫颈炎的病因之一。但支原体在生殖系统感染中的具体作用尚未明确，应谨慎解读检验结果。多数生殖器疱疹由单纯疱疹病毒2型引起，可频繁复发，也可引起新生儿感染。另外，多项病原体联合检测的产品建议首要关注临床需要鉴别诊断的情况，以及对于后续医疗决策制定的影响，比如用于指导临床处置或者药物治疗方案的选择等。

以下将以两类典型产品为例，共同探讨出于对产品临床使用安全有效性的考虑，技术审评对该类产品设计开发阶段分析性能评估关键要素的考虑。

1.生殖道病原体核酸检测试剂的通用要求

1.1 质量控制方法的选择

内对照和质控品的设置：其中内对照是与目标病原体核酸共同参与提取和扩增的核酸序列，可以是人的管家基因或者外源加入的质粒。阳性质控品用于模拟临床阳性样本，包含目标基因。阴性质控品用于对污染造成的假阳性结果进行质量控制，可以是样本收集保存介质。注意内对照和质控品在整个试验过程中应同步参与核酸提取、基因扩增和检测过程，并对其检测结果（如Ct值）做出明确的范围要求[1-3]。

1.2 准确度和灵敏度的评价

推荐采用企业内部参考品进行阴阳性参考品符合率的评价，或者采用临床样本进行方法学比对研究。

1.3 精密度的评价

推荐对可能影响精密度的主要变量进行验证，评估重复性和重现性（中间精密度），内容包括运行内的变异和运行间、日内、日间、批次间、操作者间、仪器间和地点间的变异。方法可采用设定5～20d的评价周期，使用标准菌株、临床分离培养物、临床样本或质控物质进行试验，包含阴性样本、弱阳性样本以及中等/强阳性样本。注意评价时纳入核酸分离纯化步骤。另外建议对不同水平的沙眼衣原体和淋病奈瑟菌样本排列组合进行研究。

1.4 交叉反应的评价

建议使用弱阳性样本在病毒或细菌感染的医学相关水平进行评价。用于验证的病原体或者基因序列种类主要考虑几种可能性，例如与靶位点存在同源性序列的人基因组序列，可能存在于人类泌尿、生殖道的微生物基因组序列，其他性传播疾病的病原体基因序列，易引起相同或相似临床症状的其他病原体基因序列，也就是需要鉴别诊断的情形；以及其他常见的病原体。另外，注意充分考虑多种病原体混合感染的情况，避免相互之间可能存在的干扰，例如对于沙眼衣原体和淋病奈瑟菌应验证相互之间的交叉反应。

1.5 抗干扰能力的评价

建议使用每种干扰物质的潜在最大浓度进行研究，可考虑纳入内源性、外源性和其他已报道的潜在干扰物质。针对不同样本类型，应分别评价可能存在的干扰情况。例如拭子样本可选取全血、黏蛋白、宫颈黏液、阴道常用药物等进行验证，尿液样本可选取血液、胆红素、抗生素等进行验证，并明确不产生干扰的最高限值。

1.6 样本的适用性

对于该类产品，样本中病原体的载量十分关键。这就需要对样本的适用性进行相应的确认，以保证检测结果的可靠，包括对样本的收集、运输和储存、制备或处理的方式进行验证。

针对不同的样本类型（如宫颈拭子或尿道拭子）、取样部位（如宫颈或阴道），可能有不同的采样方法以及多种样本保存介质。对于各种类型的样本以及不同的保存介质，建议分别进行最低检测限和精密度等性能的评价以及样本稳定性的研究。

由于此类产品的样本采集方法不易实施标准化操作，并且采样不当可能导致产生假阴性结果，建议针对不同的采样方法与标准化方法进行同源样本的比较研究。

1.7 产品检验

在对产品分析性能进行系统全面的评价之后，根据其研究结果，即可编制产品技术要求。其中性能指标和检验方法的确定应在对其适用性进行合理判定的基础上，符合相关国家标准品、参考品的要求，并且相应地进行产品检验。

对于HPV检测试剂，包括核酸检测和基因分型试剂，如果靶序列为HPV L1基因DNA，应使用人乳头瘤病毒L1基因分型参考品进行检验并且符合参考品说明书的要求；如果靶序列为非L1基因DNA和全基因组，则适用于人乳头瘤病毒全基因组分型参考品。对于淋病奈瑟菌检测试剂，现有适用的淋病PCR试剂盒参考品。对于沙眼衣原体检测产品，尚无适用的国家参考品；故应在科学合理设置企业参考品的前提下，满足企业参考品的要求。

1.8 阳性判断值的确定

阳性判断值的准确设定是产品在临床应用中具有较高灵敏度和特异性的前提。这里推荐企业考虑不同地区流行病学背景以及人口统计学特征（包括性别、地域、种族）的差异，从预期适用人群中选择具有代表性的样本建立阳性判断值，注意纳入一定数量的弱阳性样本。

建议采用受试者工作特征曲线（ROC）的方法确定阳性判断值；同时可从临床意义的角度出发，合理地设置灰区。另外，考虑到建立阳性判断值时使用的受试者样本对于目标人群的代表性可能不够充分，鼓励企业后续通过临床试验进一步确认阳性判断值的准确性。

2.高危型人乳头瘤病毒检测试剂[2]

多年来，宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的诊断主要遵循宫颈细胞学、阴道镜及组织病理学检查的三阶梯程序。高危型HPV检测试剂一般用于宫颈细胞学检查异常患者的分流及30岁以上女性的宫颈癌筛查，与细胞学检查相比具有更高的敏感度以及高级别宫颈病变的检出率，可以减少阴道镜转诊率，并且能够延长筛查的时间间隔。因而有助于临床诊疗过程中更加准确地判断疾病以及科学的管理患者。

HPV核酸检测试剂用于上述分流或宫颈癌筛查时，应覆盖的HPV基因型别建议包含目前国际公认的13种高危型，也可同时包中等风险型别中的一个或多个。如果可检测的HPV基因型别不能完全涵盖上述高危型别，则可能造成产品的阴性预测值无法满足临床使用需求。对于基因分型试剂，目前公认有临床意义的用途为16、18型的基因分型检测用于辅助宫颈癌筛查中HPV核酸阳性检测结果的分析是；其他分型的意义尚待进一步研究确认。另外，低危型HPV一般与低度鳞状上皮内病变或尖锐湿疣相关，其检测的临床意义有限，故不建议包含在产品的覆盖范围内。

2.1 企业参考品的设置

阳性和灵敏度参考品可采用多个标准菌株或者临床分离培养物添加至阴性样本进行制备。阴性参考品则主要考虑分析特异性的评价，可为经确认无靶基因序列或者易产生交叉反应的样本，或者其他病原体样本。阳性和灵敏度参考品可为感染HPV的细胞系，或者人工合成的HPV DNA或RNA。值得注意的是无论产品能否进行HPV基因分型检测，均应针对所有可检出的HPV基因型分别设置阳性参考品和灵敏度参考品。阴性参考品建议纳入不在检测范围内的其他低危型HPV基因型样本。企业参考品的基质建议与临床适用的样本及其收集保存介质一致。

2.2 最低检测限的评价

对于HPV检测产品，可针对每种不同的HPV基因型分别配制系列稀释的样本，将95%的阳性检出率水平作为最低检测限确定的标准。

3.沙眼衣原体和淋病奈瑟菌检测试剂[3]

生殖道沙眼衣原体感染和淋病是我国常见的性传播疾病，可引起的疾病范围广泛。例如泌尿生殖系统的化脓性炎症、不孕或异位妊娠、眼、咽、直肠、盆腔等部位的感染，也可发生母婴传播导致新生儿结膜炎等。如不及时治愈可出现严重的并发症和后遗症。沙眼衣原体难以培养，现有抗原检测的灵敏度和特异性均较低，淋病奈瑟菌分离培养与涂片检查结果也存在不一致的情况。而采用实时荧光PCR等方法的沙眼衣原体和淋病奈瑟菌检测试剂可用于泌尿生殖道相关病原体感染的鉴别诊断，同时，依据流行病学史、临床表现及其他实验室检查进行综合分析，有助于临床诊疗过程中更加准确地判断疾病。

3.1 企业参考品的设置

沙眼衣原体和淋病奈瑟菌核酸检测试剂用于泌尿生殖道相关病原体感染的鉴别诊断时，应根据流行病学研究证据，充分覆盖中国人群中常见的各种沙眼衣原体血清型以及淋病奈瑟菌不同变异来源的参考菌株，以验证产品的检出能力，并根据上述要求选取阳性参考品和灵敏度参考品。可用于产品性能评价的典型沙眼衣原体血清型有D型、E型、F型或G型；淋病奈瑟菌菌株可来源于CMCC或者ATCC，也可使用WHO标准菌株进行研究。如果不同血清型或者菌株的最低检出限存在差异，也应分别设置阳性参考品和灵敏度参考品。阴性参考品则主要考虑检测特异性的评价。

3.2 最低检测限的评价

建议覆盖不同来源的多个血清型或菌株（例如耐药株），并分别明确代表性血清型或菌株的检出限。然后，建议在检出限或附近的浓度对所有可检出的菌株或血清型进行验证。首选与临床样本使用相同的基质。

4.小结

本文探讨了生殖道病原体核酸检测试剂临床前研究中分析性能评估的要点，希望能为产品的设计开发以及注册申报提供帮助。同样也期待能从保障产品性能，指导检验人员正确使用以及医生对于检验结果做出合理解释的角度，为临床应用中面临的一些问题提示有效的解决方法。