TFEB调控机制及其靶向药物的研究进展

陈小翠，杨 陈，李志航，刘华锋

(广东医科大学附属医院肾病研究所，湛江市慢性肾脏病防控重点实验室，广东 湛江 524001)

1 TFEB结构简述

人类小眼畸形转录因子(microphthalmia-associated transcription，MIT)家族属于Myc转录因子超家族，具有典型的螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链(basic helix-loop-helix leucine zipper，bHLHZip)结构。该家族包含转录因子EB(transcription factor EB，TFEB)、转录因子EC、转录因子E3(transcription factor E3，TFE3)及小眼畸形相关转录因子四个成员，在所有脊椎类动物中保守存在，并且在结构上有相似之处。TFEB作为该家族的成员之一，定位于6号染色体上，全长52 246 bp，其中有8个外显子，8个转录本，编码蛋白长度为19～159个氨基酸不等。

TFEB作为MIT家族成员中的一个转录调节因子，其与bHLHZip区域特异性结合并识别回文CACGTG E-盒序列，同时能够识别其他bHLHZip转录因子不具有的不对称TCATGTG M-盒序列，表达出表观分子量分别约为60 ku和53 ku的蛋白。其侧接上游碱性区域，可与同源或异源寡聚化和高亲和性的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)基团进行结合。在无DNA基团的情况下，四聚体大小的TFEB解离为DNA二聚体形式。

2 TFEB的功能简述

2.1 生理学作用目前已明确的TFEB下游基因有400多个，被证实调控自噬-溶酶体通路相关基因有73个。包括溶酶体水解酶和辅助蛋白基因23个；溶酶体膜蛋白相关基因9个；溶酶体V-ATP酶泵基因14个；溶酶体生物发生调节子相关基因10个和自噬调节基因17个。当细胞遭受饥饿、溶酶体应激、线粒体损伤等因素刺激时，定位于溶酶体膜上的TFEB发生去磷酸化入核，与介导溶酶体新生基因结合，促进溶酶体新生，维持细胞稳态。同时其在调控天然免疫和适应性免疫以及其他细胞代谢及分化过程中均发挥至关重要的作用。

2.2 TFEB异常调控参与多种疾病的发生发展TFEB正常表达可维持细胞稳态及调节免疫。而其表达或调节异常与人类多种疾病密切相关。

有学者发现，控制TFEB转录的染色体发生易位时，TFEB高度活化，介导了肾癌[1]的发生；而TFEB在内皮细胞中的过度表达却可有效地抑制炎症[2]。另有研究表明，TFEB表达降低时，可导致机体发生糖脂代谢紊乱、胱氨酸尿症、溶酶体储积症以及各种神经退行性疾病的进展。此外TFEB的结构或功能失调在硫酸酯酶缺乏症、庞贝氏症和抗胰蛋白酶缺乏症等疾病的发生发展过程中也得到了证实。

由于TFEB在多种疾病的发生发展进程中的关键作用，了解其作用机制，以及如何通过调控其机制进而延缓疾病的进展，具有重要的意义。

3 TFEB具体调控机制

3.1 转录层面调控启动子是核糖核酸 (ribonucleic acid，RNA) 聚合酶特异性识别和结合DNA的序列，是基因的一个组成部分，控制着基因的转录起始时间及表达程度。人的TFEB启动子序列是其上游的1 986 bp片段。有学者研究发现染色体易位导致第6号染色体上的TFEB开放阅读框与第11号染色体上的非蛋白质编码α基因的5'调节区融合，TFEB启动子被替换，导致TFEB转录水平明显上调以及使TFEB蛋白质表达量增高达60倍，高表达的TFEB导致肾肿瘤的发生[1]。

另外，Alghamdi等[3]研究发现活化JAK可促进下游的转录因子信号传导及转录激活因子1与TFEB启动子结合，促使TFEB的转录活性升高，沉默Janus激酶2可降低TFEB启动子活性，降低TFEB转录，蛋白质表达及去磷酸化入核，导致TFEB所介导自噬功能发生受损。而胱氨酸肾病基因表达沉默的人肝癌细胞、胱氨酸蛋白酶所致的胱氨酸尿症、人类免疫缺陷病毒感染后的患者均出现了TFEB转录水平的下降，导致了疾病的发生及加速了疾病的进展。

另有研究表明，不同浓度的H2O2刺激293T细胞，表现为TFEB mRNA水平及TFEB蛋白水平升高，同时促进TFEB的核易位进而应对活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的损伤刺激[4]，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)处理的巨噬细胞、单胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)处理影响心肌细胞以及抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)和SS-31的作用，均观察到作用于TFEB的转录水平所起到的保护性作用。

除启动子的调控外，近期也有少量的研究发现非编码单链RNA(microRNA，miRNA)和长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)参与调节TFEB的转录。如Malouf等[5]研究发现在TFEB高表达所致的肾癌的过程中与肺腺癌转移相关转录子1 的IncRNA融合相关，而Settembre等[6]学者研究表明TFEB作为一个功能蛋白，是miR-128的靶标，具有微调自噬的转录的作用。而Song等[7]的研究发现m6A甲基转移酶和ALKB同源蛋白5可通过与TFEB的3'-UTR末端结合，使TFEB末端的两个m6A残基发生甲基化修饰，反向调控TFEB的转录活性，从而在缺血性心脏病中起保护作用。

3.2 蛋白修饰层面调控目前关于TFEB调节的研究，关注最多的是蛋白修饰层面的调控，尤其是各种因素介导的TFEB去磷酸化入核的调控，下面就各种调节形式介导的磷酸化调节进行简单阐述。

3.2.1依赖于mTOR的磷酸化调节 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是细胞内一类丝/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，是介导溶酶体再生的一个激活位点。mTOR作为一个营养传感器，与TFEB的功能息息相关。根据细胞的营养状态，TFEB遵循两种不同的循环：在氨基酸丰富时，它在溶酶体和胞质溶胶之间连续穿梭，而在饥饿时它从胞质溶胶转运到细胞核。近年来，有研究显示mTORC1介导TFEB的S211氨基酸基团磷酸化。当应用mTOR抑制剂Torin1抑制其活性时S211A弥散存在于胞质中，TFEB发生核易位。该研究还表明S122D的突变可以阻断S211A的作用，进而使TFEB发生核易位[8]。另有研究发现，mTORC1介导的TFEB的S211磷酸基团的活性依赖于YWHA(14-3-3)蛋白的状态。14-3-3是使TFEB在胞质溶胶中保持隔离的胞质分子伴侣蛋白，是将TFEB定位于细胞质中的一个阻遏物。在营养丰富状态下，Rag GTP酶具有活性，可募集合成代谢激酶复合物mTOR，使TFEB的丝氨酸S211残基发生磷酸化产生14-3-3的结合位点，促进TFEB与14-3-3蛋白结合，形成复合物，使TFEB的Rag结合结构域被14-3-3蛋白掩盖，TFEB失活，从而保留在胞质中。在营养缺乏所致的氨基酸减少或缺失的情况下，Rag GTP酶和mTORC1被灭活。TFEB/14-3-3复合物发生解离，解离后的TFEB迅速发生去磷酸化入核，启动下游基因，调节相应生物学过程，以维持细胞的稳态。有趣的是，有学者在mTORC1抑制的过程发现，除了S211发生去磷酸化外，S142也发生去磷酸化，但其去磷酸化之后所发挥的作用是否跟TFEB的核转运有关至今尚未明确。

3.2.2依赖PKC的磷酸化调节 蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是一个非依赖于mTOR而调节TFEB活化的因子。有研究显示蛋白激酶C的β亚基(PKC β)与TFEB的核易位密切相关。TFEB包含一个丝氨酸丰富的C末端区域，PKC β参与该末端区域磷酸化。在小鼠的破骨细胞中，使用PKC活化剂诱导磷酸化丝氨酸残基(S462A/S463A/S466A/S467A/S469A)而激活PKC β，可观察到TFEB核转运现象，而PKC α和PKC δ的激活不会通过磷酸化C末端引发TFEB核易位。另一项研究表明，TFEB可突变相应PKC β保守的C末端的丝氨酸残基(S462，S463，S466，S467和S469)而不是N端氨基酸(氨基酸88-219)[9]使天冬氨酸磷酸化。由此导致的丝氨酸及天冬氨酸的突变，核易位增加。该现象表明，PKC β末端残基的磷酸化可能伴随着TFEB的核易位。且该现象的出现并不伴随着细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)所介导的TFEB的丝氨酸末端残基S142A的磷酸化以及mTORC1活性的变化。这说明了PKC β所介导的TFEB核转位现象并不依赖于ERK及mTORC1而发挥作用。但有趣的是，虽然PKC α和PKC δ亚基不可直接影响磷酸化TFEB的活性，但其可通过抑制糖原合成酶激酶3β亚型(glycogen synthase kinase 3 β，GSK3β)上游诱导TFEB激活。GSK3β主要通过磷酸化S134和S138位点与mTORC1相互作用，增加S211A的磷酸化，加速TFEB与14-3-3蛋白的结合，抑制TFEB的核转运。由于PKC位于很多信号通路的下游, 包括G蛋白偶联受体介导的GαQ/11信号、甘油二酯、Toll样受体的先天免疫和受体酪氨酸激酶过程。因此，佛波醇酯、血管紧张素II以及LPS均依赖于PKC所介导的TFEB活化。

3.2.3钙调磷酸酶的脱磷酸化调节 钙调磷酸酶(calcineurin，CaN)是迄今发现的唯一受Ca2+或钙调蛋白调节的丝/苏氨酸蛋白质。参与多种信号转导通路，且可调节TFEB的核转运。当细胞处于饥饿时，S211发生去磷酸化，TFEB迅速转运入核。而这个去磷酸化过程目前被认为有两种调节方式：1)通过减少mTORC1的活性减少S211的磷酸化；2)通过直接调控S211释放粘质蛋白1(mucolipin 1，MCOLN1)以及激活钙调神经磷酸酶的活性。减少mTORC1的活性进而减少S211的磷酸化，使TFEB-14-3-3复合物发生解离启动TFEB的入核，前面已经阐述。如何直接调控S211释放MCOLN1以及激活钙调神经磷酸酶的活性，调节TFEB核转位是问题的关键。

研究表明，在人类IV型脂质沉积症以及人的成纤维细胞饥饿后，TFEB的核易位是减少的。而人类成纤维细胞在饥饿时，核转运并没有减少。这种看似相反现象的出现与什么因素相关？最近的一项研究发现，过表达TFEB促进溶酶体定位于质膜表面，同时增加溶酶体Ca2+的缓冲能力[10]。溶酶体缓冲能力也随着饥饿程度的增加而增加，形成一个正反馈回路，进一步说明溶酶体钙的重要性。另有研究发现，鞘氨醇作为酸性储存钙释放的一个正向调节器，可调节TFEB核易位从而调节自噬[11]。因此，溶酶体的钙和钙调神经磷酸酶在S211、S142这两个氨基酸残基在参与TFEB去磷酸化的亚细胞定位过程中发挥重要作用，尽管如何通过该通路发挥作用，至今尚未明确。而使用氧化剂氯胺T或已知内源性产物ROS(如鱼藤酮、过氧化氢、氰氯苯腙)进行处理，伴随着溶酶体MCOLN1钙释放和CaN的激活，TFEB被诱导激活[12]。且该研究还表明CaN与TFEB物理特性相关。以上研究充分证明CaN的激活足以控制TFEB核易位。饥饿导致增加溶酶体钙释放和CaN的活化可以直接使TFEB发生去磷酸化。

除了上述所提及的依赖或非依赖于mTOR的磷酸化修饰TFEB作用外，ERK信号、腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)通路、蛋白激酶B信号通路或GSK3均可在TFEB的不同Ser磷酸化位点与TFEB结合介导其磷酸化及去磷酸状态。甚至有研究表明，在总的TFEB表达明显增高的情况下，磷酸化的TFEB可被调节入核，但是确实存在该现象，仍需进一步证实。总之，调节TFEB的核易位，在维持细胞稳态的过程中至关重要。

3.2.4TFEB蛋白分子的乙酰化调节 乙酰化是将乙酰基转移到氨基酸侧链基团的过程。TFEB的乙酰化修饰是否会对TFEB的活性造成影响，是研究者关注的另一问题。Bao等[13]学者的研究表明，在阿尔茨海默病患者的在小胶质细胞中，K116R突变体可使TFEB在赖氨酸116位点发生乙酰化(含有乙酰赖氨酸的肽FAAHISPAQGSPKPPPAASPGVR与TFEB进行免疫共沉淀实验，发现在K116位点发现有区域的匹配，在该位点在进化中高度保守)促使TFEB发生核易位，入核后的乙酰化TFEB与SIRT1蛋白结合，发生翻译后修饰，SIRT1介导的TFEB去乙酰化通过增强溶酶体生物合成促进含纤维样β-淀粉样蛋白的小胶质细胞降解和使淀粉样蛋白斑块减少。

TFEB在乙酰化入核后需要在核内进行适当的修饰才能发挥作用，且与前面去磷酸化入核的作用不同，是否去磷酸化入核也需要相应的翻译后修饰，而其他尚未知道的如泛素化修饰、甲基化修饰等过程是否也涉及这种调节机制，至今仍然是个谜。

3.3 核内抑制因子对TFEB的调节TFEB除受上述因素的调节外，其活性受核内抑制因子的调控。ZKSCAN(ZNF306)属于含有KRAB和SCAN结构域的锌指转录因子家族。该转录阻遏蛋白家族在细胞中发挥的作用包括细胞增殖、凋亡、核仁维持和肿瘤转化，且该家族DNA结合蛋白ZKSCAN3能够抑制已知参与自噬和溶酶体功能的60多种TFEB靶基因的转录，并在沉默时可增加TFEB所介导的自噬及溶酶体新生。且研究表明至少一部分自噬和溶酶体基因(sgsh，hexa，ctsa，atp6v1e1，stomatin，granulin，map1lc3b)被ZKSCAN3和TFEB反向调控。TFEB过表达的HeLa细胞(以下简称TFEB细胞)敲低ZKSCAN3，TFEB介导的下游相关基因的表达水平超过单独TFEB过表达所达到的水平。该现象提示了两个转录因子在调节自噬及溶酶体功能过程中偶联。此外，饥饿或Torin1刺激可发现ZKSCAN3在细胞质堆积，而TFEB发生核易位，该现象进一步说明了ZKSCAN3和TFEB可能通过完全相反的机制协调应对饥饿和其他外界因素的刺激，且有学者研究发现激活PKC可使GSK3β失活， TFEB发生磷酸化，核易位及活化水平降低，而PKC激活同时可导致c-Jun氨基末端激酶磷酸化使ZKSCAN3去磷酸化入核[14]，并发现依赖于mTOR的形式可将TFEB与ZKSCAN3两个并行信号偶联。而Chauhan等[15]也在细胞饥饿时观察到相同的现象。除了阻遏蛋白ZKSCAN3外，新近学者的相关研究表明TFEB还受到负调控转录因子MXL3(Max-like 3)及FOXK等的共同调节，进而维持机体的稳态。

3.4 TFEB的降解蛋白质的合成过程受多种因素的影响，包括转录、翻译及翻译后修饰等，TFEB作为一个关键的靶蛋白分子也不例外。

近来学者研究发现使用自噬诱导剂氯喹刺激细胞15小时，TFEB蛋白表达减少[16]。而在戈谢病患者体内发现，突变细胞的TFEB受蛋白酶体系统的降解增加，最终导致疾病的进展，且这种突变细胞是受突变体GCase的影响同时调控了TFEB转录及翻译的稳定。而针对戈谢病患者的成纤维细胞的研究：用溴环已胺醇，有助于逆转突变体GCase对TFEB的影响，阻断蛋白酶体降解TFEB的能力，使TFEB mRNA的上调和蛋白表达升高。Takamitsu等[17]学者的研究表明接触金属银24 h后，TFEB的蛋白质及mRNA表达下降，但是并不影响其核易位水平。在MAO刺激、抗氧化剂NAC及胱氨酸尿症患者的细胞均观察到相同的现象。综上，TFEB蛋白分子的降解增多，对疾病的进展也起着不可或缺的作用。

4 调节TFEB的药物

在了解上述调节机制的基础上，研究者逐渐寻找靶向调节TFEB的药物，并取得一些进展。

4.1 促进TFEB转录及表达近来有研究表明部分药物可能通过干预TFEB启动子，影响其转录，如Zhang等[18]发现，姜黄素可增加人结肠癌HCT116细胞和小鼠胚胎成纤维细胞的死亡，其主要通过结合TFEB的启动子增加其转录活性并促进核易位[18]。Awad等[19]研究发现，在戈谢病中，重组GCase可增加TFEB的稳定性并上调TFEB靶基因表达，促进溶酶体新生，改善致病基因?(葡萄糖脑苷脂酶基因)对TFEB介导溶酶体新生功能的抑制作用[19]。而使用不同浓度红景天苷作用24h后，TFEB mRNA表达显着增加同时可促进TFEB去磷酸化入核，增加TFEB活性。Arunava等[20]学者的研究发现使用过氧化物酶体增殖物激活型受体α的激动剂吉非贝齐与全反式视黄酸可通过与TFEB的启动子PPRE-和RXR-结合位点结合，增强脑细胞中的TFEB表达,调节自噬-溶酶体通路，进而在溶酶体储积症中起治疗作用；此外，Moskot等学者发现染料木黄酮可提高TFEB基因表达水平及抑制mTOR使TFEB去磷酸化入核，改善溶酶体储积症。而3,4-二甲氧基查耳酮也被证实可提高TFEB的表达水平，改善自噬流，起到保护心脏的作用。

4.2 促进TFEB去磷酸化及入核除介导TFEB的转录和蛋白表达上升的药物外，调节TFEB去磷酸化入核的药物也有所发现。如前述药物姜黄素及红景天苷在启动TFEB转录时，也可促进其蛋白去磷酸化增加其活性，发挥相应的治疗作用。另外，mTOR特异性抑制剂Torin1、PP242、雷帕霉素及抗炎物质柚皮素等也可使TFEB发生去磷酸化入核，进而改善相应的疾病；而Song等[21]的研究发现，化合物Compound C1可直接结合TFEB的N端介导其核转运，成为神经退行性疾病的潜在治疗药物[21]；Zhitomirsky等[22]发现，抗肿瘤药物多柔比星和米托蒽醌可使TFEB发生核转位促进溶酶体新生，针对TFEB的靶点进行隔离是克服抗肿瘤药物耐药性的新策略；Zhang等[23]发现海藻糖可通过阻断肝细胞代谢而激活经典型的适应性禁食信号，激活肝脏及肝外组织的过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子(peroxisome proliferative activated receptor γ coactivator 1α，PGC-1α)-成纤维细胞生长因子21信号通路进而激活TFEB的去磷酸化入核。而在Batten疾病模型小鼠的研究中发现，海藻糖和MK2206通过抑制AKT而非ERK的活性加速TFEB的去磷酸化入核，促进神经退行性疾病如帕金森病患者神经元的α-synuclein的清除，保护多巴胺神经元[24-25]；此外，还有学者发现，海藻糖可通过调节叉头转录因子O3的磷酸化激活，增加共激活因子相关的精氨酸甲基转移酶1的活性，增加TFEB的核转位诱导运动神经元变性模型的自噬，以及通过促发溶酶体膜透化释放Ca2+激活PPP3介导TFEB去磷酸化入核起到保护神经元的作用；不仅如此，Wu等人的研究发现，海藻糖还可以通过抑制AKT激活AMPK使TFEB活化及发生核转运，发挥调节自噬的作用，抑制氧化应激及凋亡，提高移植皮瓣的生存率[26]。使用雌激素相关受体α及雌激素相关受体γ的抑制剂或敲低其基因，可增加PGC-1α mRNA的表达进而使GSK3β活性降低，TFEB的核移位增多；而受体相互作用蛋白激酶1抑制剂也可增加TFEB的核定位，从而促进自噬。

针对TFEB调节机制的靶向调节药物中，目前研究仅局限于转录层面及蛋白层面，且在蛋白层面的调节主要集中在TFEB的去磷酸化入核，增加其活性的基础上进行阐述，针对TFEB蛋白的乙酰化目前尚未有干预药物。此外，在针对TFEB的负调控因子ZKSCAN3、MXL-3及叉头样转录因子等的干预药物以及抑制TFEB降解的药物仍有待进一步的研究。

5 总结

TFEB作为调节细胞稳态及机体发病过程的一个重要转录因子，其调节机制在机体的各个层面发挥着重要的作用。随着分子生物学研究的不断深入，调节TFEB的各种机制及针对各种机制的靶向药物均得到了一定程度的认识。该综述旨在总结TFEB蛋白分子的调控机制及其靶向调节药物为进一步探讨及研究受TFEB调节异常所致的各种疾病提供新的药物治疗方向。