无患子皂苷对高糖诱导H9C2心肌细胞损伤的保护作用

朱敏航，李紫薇，陈玄立，袁 琼，周乾毅，张永忠

(武汉科技大学 医学院 新药创制研究所 职业危害识别与控制湖北省重点实验室，湖北 武汉 430065)

糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一种由于糖代谢紊乱引起心脏结构和功能障碍为主要病理改变的心肌病变。随着生活质量的提高，糖尿病的发病率也逐渐增高，继发于糖尿病的心血管并发症逐渐成为糖尿病患者死亡的主要原因。流行病学研究发现，糖尿病患者70%以上死于心血管系统疾病，是非糖尿病患者心血管系统疾病病死率的2～3倍，许多研究证实心肌细胞焦亡可能参与其中[1]。近年来研究发现慢性炎症和能量代谢异常的发生关系密切，认为趋化因子和促炎性细胞因子诱导的慢性炎症过程是糖尿病心肌病心肌损伤的重要发病机制之一[2-3]。

无患子皂苷(Soapnut Saponin)是从野生落叶乔木无患子(SapindusmukorossiGaertn.)果皮中提取出来的一类皂苷类化合物。其果皮提取物中主要活性成分为三萜皂苷类(Ⅰ)、倍半萜糖苷类(Ⅱ)、蛋白质和脂肪油，其中三萜皂苷类、倍半萜糖苷类，已证实对人体皮肤有抗菌、杀菌、消炎和祛屑止痒功效，除此之外还含有多种有益于人体的物质[4]。糖尿病引起的高血糖会促进血小板聚集，又可引起脂质过氧化物合成增加。大量研究表明，Ⅱ型糖尿病的氧化应激能耗尽抗氧化防御系统的活性，导致氧自由基增多。同时，脂质过氧化物的分解产物为一种很强的具有生物毒性的物质[5]。有研究表明大多数皂苷具有显著的抗氧化作用，可清除体内氧自由基，显示出抗血小板聚集的活性。采用乳酸脱氢酶泄露分析方法测定无患子皂苷，没有明显的细胞毒活性，还表现出比阿司匹林具有更强的抗血小板聚集的活性[6]。

本研究拟探究无患子皂苷对高糖诱导的心肌细胞损伤保护作用机制，为糖尿病性心肌病的治疗提供新思路。

1 材料

1.1 药材

成熟无患子果实(SapindusmukorossiGaertn′s fruit)：2017年收取于武汉科技大学黄家湖校区无患子树，果实由张永忠副教授鉴定并存放于武汉科技大学医学院。

1.2 细胞株

H9C2心肌细胞株(上海ATCC细胞库)，经复苏后，于含有10%FBS的DMEM完全培养基培养。

1.3 试剂

齐墩果酸对照品(上海阿拉丁生化科技有限公司)；二甲双胍(源叶生物技术有限公司，LOT：Y12J7C16020)；caspase-1及β-actin抗体(鼠抗，Santa Cruz Blotechnology)；IL-1β及NLRP3抗体(兔抗，Cell Signaling Technology)；抗鼠及抗兔二抗(武汉科瑞生物技术有限公司)；SP免疫组化检测试剂盒及DAB工作液(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.4 仪器

CO2培养箱(力康Heal Force)；超净工作台(SW-CJ-1FD，苏州净化设备有限公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus)；酶标仪(Biotek Epoch)；CCD成像系统(Laica Microsystems，型号DM750)；台式高速冷冻离心机(Eppendorf，型号 5427R)。

2方法

2.1 无患子皂苷的提取和纯化

无患子果皮洗净、晾干、粉碎，称取无患子药材粉末(过三号筛)约2.5 g。精密测定，加6倍量85%乙醇回流提取3次，每次2 h，得无患子皂苷的提取液，用旋转蒸发仪回收乙醇至无醇味，加150 mL蒸馏水溶解，水饱和的醋酸乙酯萃取3次，每次80 mL，弃去醋酸乙酯层，合并水层。再用D101大孔树脂纯化，以3BV/H的速度进行洗脱，收集50%的洗脱液，洗脱液经旋转蒸发仪进行浓缩。制备标准曲线，经过计算，无患子皂苷浓度以齐墩果酸计为12.58 mg/mL。

2.2 细胞培养及实验分组

H9C2心肌细胞株常规复苏后加入DMEM培养基(含糖量15 mmol/L)、CO2培养箱培养(37 ℃，5 % CO2)。实验共分六组：正常对照组、高糖损伤组、低剂量无患子皂苷处理组(3 μmol/L)、中剂量无患子皂苷处理组(10 μmol/L)、高剂量无患子皂苷处理组(30 μmol/L)以及二甲双胍处理组(50 μmol/L)。正常对照组细胞采用含糖量15 mmol/L的DMEM培养基培养，高糖损伤组细胞采用含糖量50 mmol/L的DMEM培养基培养，无患子皂苷处理组和二甲双胍处理组则在高糖损伤组的基础上给予不同剂量的无患子皂苷和二甲双胍进行处理，处理时间均为48 h。

2.3 Western blot实验

各组处理后的细胞使用RIPA裂解液裂解并提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转膜，5%脱脂奶粉封闭，TBST洗膜3次，封闭后孵育相应目的蛋白的抗体：caspase-1及β-actin抗体(鼠抗，1∶2000)、IL-1β及NLRP3抗体(兔抗，1∶2 000)4 ℃过夜，TBST洗膜3次后室温孵育Ⅱ抗，HRP-抗兔(1∶1 000)、HRP-抗鼠(1∶2 000)1 h，洗膜3次，ECL显影。

2.4 细胞爬片制作

DMEM培养基(含糖量15 mmol/L)培养的H9C2心肌细胞胰酶消化后按8×104个/孔的密度种于放有多聚赖氨酸包被的无菌圆形盖玻片的24孔板内，置于二氧化碳细胞培养箱中培养12 h待细胞贴壁后分组给药，继续培养48 h用4%的多聚甲醛固定备用。

2.5 SP免疫组化实验

取出细胞爬片后PBS洗两次，0.5% Triton通透处理15 min，采用SP法严格按照说明书操作检测caspase-1(1∶100)、IL-1β(1∶100)及NLRP3(1∶200)蛋白表达情况，DAB显色，PBS代替一抗做阴性对照。显色完毕后，90%甘油封片，在CCD成像系统下观察并采集图像，每组随机选取5个视野进行平均光密度测量，并计算其均值后进行统计学分析。

2.6 统计学方法

所有实验均重复3次，所取得的数据均采用IBM SPSS Statistics 19.0和GraphPad Prism 5.0统计软件进行处理。采用单因素方差分析进行多组比较，P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 高糖损伤H9C2细胞模型建立

采用免疫组化和Western Blot检测细胞中caspase-1、IL-1β蛋白表达情况，结果见图1。免疫组化结果显示高糖损伤组caspase-1、IL-1β两种蛋白表达水平相较于正常对照组均明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。Western Blot结果同样显示高糖损伤组caspase-1、IL-1β两种蛋白表达水平相较于正常对照组明显升高，差异具有统计学意义(P< 0.01)。结果提示高糖诱导了H9C2心肌细胞的焦亡，高糖损伤细胞焦亡模型建立成功。

3.2 无患子皂苷抑制高糖诱导的H9C2心肌细胞焦亡

采用免疫组化和Western Blot检测细胞中caspase-1、IL-1β蛋白表达情况，结果见图1。免疫组化和Western Blot结果均显示无患子皂苷处理组caspase-1及IL-1β两种蛋白表达水平相较于高糖损伤组均降低，差异具有统计学意义(P< 0.01)，呈剂量依赖现象。与高糖损伤组相比，二甲双胍处理组caspase-1及IL-1β两种蛋白表达水平降低，差异具有统计学意义(P< 0.01)。高剂量无患子皂苷处理组与二甲双胍处理组效果相当。

(a)免疫组化光镜图(DAB显色，400×)；(b)免疫组化结果统计图；(c)Western Blot检测结果及统计图。+P< 0.05，++P< 0.01 VS 对照组；*P< 0.05，**P< 0.01 VS 高糖组；△P< 0.05 VS 低剂量组，▲P< 0.05 VS 中剂量组。

图1 各实验组Caspase-1、IL-1β蛋白的表达

3.3 无患子皂苷抑制高糖诱导的H9C2心肌细胞NLRP3表达

采用免疫组化和Western Blot检测六组细胞中NLRP3蛋白表达水平，结果见图2。免疫组化及Western Blot结果均显示高糖组NLRP3蛋白表达水平相较于正常对照组均明显升高，差异具有统计学意义(P< 0.01)。同时，实验结果显示NLRP3蛋白在无患子皂苷治疗组中的表达水平明显低于高糖组，且三种给药剂量呈现出不同的降低程度。高剂量无患子皂苷对高糖诱导损伤后的NLRP3表达抑制作用与二甲双胍治疗组相当。

(a)免疫组化光镜图(DAB显色，400×)；(b)免疫组化结果统计图；(c)Western Blot检测结果及统计图。+P< 0.05，++P< 0.01 VS 高糖组；*P< 0.05，**P< 0.01 VS 对照组；△P< 0.05 VS 皂苷低剂量组，▲P< 0.05 VS 皂苷中剂量组。

图2 实验各组NLRP3蛋白的表达

4 讨论

细胞焦亡是一种程序性细胞死亡，又称细胞炎性坏死，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放，进而激活强烈的炎症反应。细胞焦亡在抗击感染中具有重要作用，是机体一种重要的天然免疫反应。细胞焦亡是近年来发现并证实的一种以依赖于半胱天冬酶-1(caspase-1)，并伴有大量促炎症因子释放为特征的新的程序性细胞死亡方式。细胞焦亡的形态学特征、发生及调控机制等均不同于凋亡、坏死等其他细胞死亡方式。细胞焦亡相比于细胞凋亡(apoptosis)发生得更快，并会伴随大量促炎症因子的释放，因此可以通过检测细胞内炎症因子的表达水平以及caspase-1蛋白的表达水平来判断细胞是否发生了焦亡。本研究发现，在高糖诱导的H9C2心肌细胞损伤组中，caspase-1、IL-1β两种蛋白表达水平相较于正常对照组均明显升高，表明细胞产生了焦亡。

炎症小体是由胞浆内模式识别受体(PRRs)参与组装的一类多蛋白复合物，是天然免疫系统中十分重要的组成部分。炎症小体具有识别病原相关分子模式(PAMPs)或者宿主来源的危险信号分子(DAMPs)的能力，并能够招募和激活促炎症蛋白酶Caspase-1。活化的Caspase-1切割IL-1β和IL-18的前体，产生相应的成熟细胞因子。炎症小体的激活还能够诱发导致细胞的炎症坏死(pyroptosis)。目前已经有多种炎症小体被确定参与了针对多种病原体的宿主防御反应，病原体也已经进化出多种相应的机制来抑制炎症小体的活化。在本实验中，NLRP3蛋白表达水平的改变与caspase-1、IL-1β两种蛋白表达水平的改变趋势一致，表明无患子皂苷抑制高糖诱导的H9C2心肌细胞焦亡可能是通过NLRP3信号通路来进行调控的。

本研究对无患子皂苷的这种保护作用机制的探究也为糖尿病心肌病的治疗提供了一个新思路。自古以来，无患子一直是我国民间常用的洗涤用品，尤其常用于洁面和洗发。本实验中无患子皂苷治疗组细胞中Caspase-1、IL-1β蛋白的表达水平相较于高糖损伤组均有下降，表明无患子皂苷对高糖诱导的心肌细胞焦亡产生了抑制作用。无患子皂苷在糖尿病细胞模型中表现出来的保护作用为糖尿病心肌病的治疗提供了一个新的方案。无患子皂苷作为一种天然产物，其毒副作用较小，具有抗真菌、抗细菌多种生物活性，并且在本研究中显示出了对高糖诱导的H9C2心肌细胞焦亡的抑制作用，可能作为一种新型糖尿病性心肌病的治疗药物，抑制心肌细胞的焦亡，减轻和延缓糖尿病的心血管并发症。但是本研究仅对无患子皂苷的药理活性进行了探究，还未进行药物代谢动力学、毒理学等体内分析，是否可以正式作为临床治疗糖尿病的新药还有待进一步探究。

综上所述，高糖能够诱导H9C2心肌细胞产生焦亡，无患子皂苷对高糖诱导的H9C2心肌细胞损伤具有保护作用，且该作用通过NALP3调控caspase1、IL-1β等下游基因来实现。