肠道微生物在慢性肝病中的作用及其潜在治疗策略

时 行，曹玉珠 ，丁语石，祝娉婷，李晓曼, 2，吴媛媛, 2，陈文星, 2，王爱云, 2，陆 茵, 2

(1. 南京中医药大学药学院 江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，2. 南京中医药大学江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心，江苏 南京 210023)

肠道微生物组在慢性肝病发生发展中的作用不断被阐明，研究显示，从非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)，酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)，肝硬化到肝细胞癌(hepatocellular cancer，HCC)等多种肝脏疾病的发生发展都与肠道微生物的“功能失调”存在紧密联系。由于肝脏通过门静脉直接接收携带微生物的肠道的大部分血液供应，因此肠道微生物组和肝脏本质上紧密相连。使用非培养技术允许在短时间内对整个微生物群进行测序，例如16s rRNA测序和宏基因组分析等，这些技术的出现使研究人员能够解析肠道微生物对多种不同疾病的影响。本文将详尽总结肠道微生物在慢性肝病发病机制和进展中的作用，并阐述调节肠道微生物作为肝病治疗的潜在靶点及其作用机制。

1 肠道微生物群在慢性肝病中的作用及其机制

1.1 非酒精脂肪性肝非酒精性脂肪肝病可大致分为两类：非酒精性脂肪肝(NAFLD的非进展性形式)和非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)(NAFLD的进展形式)，NASH可能进一步发展成为肝硬化或者肝细胞癌[1]。NASH通常与2型糖尿病，心血管危险因素和肥胖有关。研究发现[2]，NAFLD患者会出现小肠细菌过度生长以及肠道生态失调的现象。越来越多的研究证实，NAFLD与肠道微生物群之间的紧密关联，这也使得肠道微生物可能成为NAFLD早期诊断的潜在标志物。Boursier等[3]对NASH患者与没有NASH的患者肠道微生物群进行比较，发现NASH患者肠道微生物群的拟杆菌属(Bacteroides)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)丰度明显增加，普氏菌属(Prevotella)丰度相对减少。Loomba等[4]通过宏基因组学分析合并纤维化(3期和4期纤维化)的NAFLD患者肠道微生物的改变，结果显示合并纤维化的NAFLD患者的大肠杆菌(Escherichia coli)和普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)丰度明显增加。Zhu等[5]研究了健康儿童、NASH儿童和肝脏生化正常的肥胖儿童的肠道微生物，发现肥胖儿童和NASH患儿的拟杆菌门(Bacteroidetes)水平明显增加，同时伴随厚壁菌门(Firmicutes)水平的减少。此外，变形菌门(Proteobacteria)，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和埃希杆菌属(Escherichia)在健康儿童和肥胖儿童中水平相近，但在NASH患者中明显升高。

遗传修饰的小鼠模型已被用于研究NAFLD相关的肠道生态失调，Rahman等[6]使用连接黏附分子1(junctional adhesion molecule 1，Jam-1)敲除小鼠证明了Jam-1缺失后，食用富含饱和脂肪、果糖和胆固醇的饮食会导致肠道通透性增加，并且会加重肝脏炎症。有趣的是，通过给予抗生素可以缓解这种炎症，这表明肠道微生物移位可能在促进肝脏免疫应答中发挥着重要的作用。另一项研究发现，黏蛋白-2(mucin-2，Muc-2)缺乏的小鼠出现肠道抗微生物蛋白编码基因Reg3b和Reg3g代偿性增加的现象，而这会引起针对NAFLD的保护性免疫应答[7]。

1.2 酒精性肝病作为临床典型的慢性疾病，ALD也与肠道微生物失衡有着紧密的联系，长期酒精摄入会造成肠道微生物数量变化、菌群移位以及肠道通透性改变，最终激活机体免疫应答，促进肝脏炎症。因此肠道微生物成为影响酒精性肝病发生发展的重要因素[8-9]。

酒精性肝炎(alcoholic hepatitis，AH)是最常见的酒精性肝病。Llopis等[10]已证实AH与肠道生态失调有关，其研究发现AH患者比没有AH的饮酒患者肠道中携带更多的双歧杆菌(Bifidobacteria)和链球菌(Streptococci)。并且肠杆菌(Enterobacteria)和链球菌(Streptococci)与AH发展呈正相关性。而奇异菌属(Atopobium)和柔嫩梭菌(Clostridium leptum)两种抗炎肠道细菌与血液胆红素的升高以及肝纤维化的发展呈负相关。研究人员将AH饮酒患者的肠道微生物移植到无菌小鼠，并将给予来自非AH患者的肠道微生物的无菌小鼠作为对照组。结果显示，与非AH患者微生物处理的小鼠相比，AH患者微生物处理的小鼠肝脏发生了明显的炎性病变、肠道渗透性明显增加并且出现肠道微生物组移位的现象。这可能与AH微生物处理的小鼠肠道出现Muc2表达减少有关[10]。此外，研究发现酒精还与产生内毒素的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)丰度的相对增加以及产生短链脂肪酸的菌群减少有关[11]。Ferrere等[12]检测了酒精对肠道微生物组的影响，观察到某些小鼠对酒精具有抵抗力，而其他小鼠对酒精敏感，其最终可导致酒精相关病变的发展，例如脂肪变性。其中，酒精敏感的小鼠肠道放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)水平增加，拟杆菌门(Bacteroidetes)比酒精抵抗小鼠少50%。当将酒精耐受小鼠粪便移植到酒精敏感小鼠时，可以有效防止酒精诱导的拟杆菌消耗以及脂肪变性的发展。

除了肠道细菌丰度的改变外，有研究显示，酒精会改变肠道真菌的组成。Yang等[13]发现酒精能诱发小鼠肠道真菌的过度生长。β-葡聚糖是真菌细胞壁的一种成分，在暴露于酒精的小鼠的体循环中发现。而用两性霉素B治疗能够减少真菌多样性和念珠菌属的过度生长，降低β-葡聚糖的转运并且改善酒精性肝脏疾病。

1.3 原发性硬化性胆管炎原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis, PSC)是一种慢性特发性胆汁淤积性肝病，其特征在于胆管的进行性炎症和纤维化。原发性硬化性胆管炎与炎症性肠病紧密相关，尤其是溃疡性结肠炎。Sabino等[14]将来自PSC患者的粪便样品与健康人群或炎症性肠病患者的粪便细菌成分进行比较，发现肠球菌属(Enterococcus)，梭杆菌属(Fusobacterium)和乳酸杆菌属(Lactobacillus)在PSC中丰度增加，同时伴随着细菌多样性的降低。与疾病稳定的患者相比，这些变化在肝硬化和既往肝移植患者中最为明显。Rossen等[15]对黏膜相关细菌的分析也发现PSC患者的肠道细菌多样性较低。此外，也有一些研究证实肠道微生物群直接参与PSC的发病过程，Mueller等[16]研究发现，细菌过度生长的动物肝脏出现PSC样病变，并且这种改变可以通过抗生素来逆转。通过培养PSC患者的胆管细胞，发现其对病原相关分子模式的敏感性明显增加，例如脂多糖。

1.4 肝细胞癌越来越多的证据表明，HCC常常伴随着肠道生态失调，如肠屏障功能障碍、细菌移位、肿瘤促进代谢物的全身循环。已有研究发现在肥胖诱导的HCC小鼠模型中梭菌属(Clostridium)的富集，而临床HCC患者的中肠道大肠杆菌(Escherichia coli)过度生长。Grat等[17]对15例接受移植治疗的肝硬化患者与15例进行移植治疗同时，具有肝硬化和肝癌的患者进行前瞻性地评估，将移植治疗前期所有HCC患者的肠道微生物与没有HCC的肝硬化患者的肠道微生物相比对，发现HCC患者的大肠杆菌(E.coli)水平明显增加。这些结果表明，大肠杆菌在HCC发生中具有潜在的作用。此外，也有研究报道人和小鼠HCC模型中存在螺杆菌属(Helicobacter)向肿瘤组织迁移的现象。值得注意的是，已有研究表明，该菌属能够通过激活NF-κB和Wnt信号传导并抑制抗肿瘤免疫来促进HCC的发展。研究发现，肠道多聚免疫球蛋白受体(polymeric immunoglobulin receptor，PIGR)能够调节IgA向肠腔的转运并维持微生物群的稳态。Shalapour等[18]研究发现，在NASH诱导PIGR敲除小鼠的HCC模型中，全身和肝脏IgA水平升高以及肝脏肿瘤发生率增加。此外，广谱抗生素(如氨苄青霉素和阿莫西林)的应用已被证明可减轻小鼠的肝脏炎症和HCC发展，这证明了肠道微生物在肝脏肿瘤发生中的作用。在另一种由二乙基亚硝胺(一种致癌物质)诱导HCC的小鼠模型中，发现了由脂多糖移位引起的TLR4活化，继而上调肝星状细胞中的肝表皮调节素水平，并激活NF-κB通路，进而诱发了肿瘤细胞增殖[19]。

2 针对慢性肝病的肠道微生物的治疗策略

2.1 抗生素抗生素具有减少肠道中细菌总数以及减少细菌移位的作用，从而抑制由肠道泄漏引起的促炎信号的激活。诺氟沙星是一种喹诺酮类药物，主要作为高危肝硬化患者自发性细菌性腹膜炎和感染的一级或二级预防药物。晚期肝硬化患者的临床试验表明，长期使用口服诺氟沙星是安全的，其能使粪便微生物中的革兰阴性菌明显减少。降低自发性细菌性腹膜炎和肝肾综合征1年再发生的概率，并提高患者生存率。利福昔明是一种具有广谱抗菌活性的抗生素，除了抗生素的典型杀菌和抑菌活性外，其还可发挥通过调节微生物组成而发挥降低内毒素和抗炎作用[20]。在早期临床试验中，利福昔明(1 200 mg· d-1)短期治疗已被证明，能够改善NAFLD / NASH患者内毒素血症和降低转氨酶[21]。利福昔明也可减少自发性细菌性腹膜炎的发展，并且可以改善门静脉高压，这表明它能有效地针对晚期肝病的肠道微生物。与诺氟沙星相似，在一些研究中已发现利福昔明可提高晚期肝硬化患者的生存率[22]。此外，不断有研究证明，通过抗生素调节肠道微生物对HCC的发生发展有着重要的影响。研究显示，通过由氨苄青霉素、新霉素、甲硝唑和万古霉素组成的口服抗生素混合物进行连续肠道灭菌能够有效地减少小鼠中由二乙基亚硝胺(diethylmitrosamine, DEN)/CCl4或二甲基苯蒽联合高脂诱导的HCC肿瘤的数量和体积。

2.2 益生菌在慢性肝病中，益生菌被用来恢复有益细菌来重新平衡肠道微生物群。已有大量研究证明，益生菌治疗肝脏疾病的有效性。一项随机试验显示，连续4个月补充VSL#3可改善儿童NAFLD，其作用机制包括调节宿主微生物、改善肠屏障功能和调节免疫系统[23]。研究发现，在ALD的小鼠模型中，给予艾克曼菌(A.muciniphila)能够改善酒精相关的肝损伤和肠屏障功能[24]。在DEN诱导的肝癌模型中，采用VSL#3(含有嗜热链球菌，短双歧杆菌，长双歧杆菌，婴儿双歧杆菌，嗜酸乳杆菌，植物乳杆菌，副干酪乳杆菌，德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌)能够减轻肠道生态失调，并且改善肠道炎症[23]。在小鼠皮下移植瘤模型中，使用抗生素组合Prohep能够减少肿瘤的体积和重量[25]。

2.3 粪便菌群移植粪便菌群移植(fecal microbiota transplantation，FMT)是将含有健康个体的细菌粪便物质移植到接受者的过程。近年来，FMT已经被越来越多的应用研究，FMT的机制可能涉及有益细菌菌株的建立和抗微生物组分的产生。Ferrere等[12]将来自酒精抵抗小鼠的粪便移植到酒精敏感的受体小鼠中，每周3次，持续3周，结果发现，FMT能够预防酒精诱导的肠道失调和肝脏脂肪性肝炎。FMT已成功用于治疗艰难梭菌(C. difficile)感染的患者，其能促进恢复肠道生态平衡，并且临床改善效果优于标准抗生素治疗。FMT具有重新恢复整个益生菌肠道环境的优势，但最佳给药途径、治疗持续时间、反应持久性仍有待确定进一步探索。

3 展望

现有的大量数据发现，NAFLD、ALD和PSC与肠道微生物“功能失调”具有紧密的相关性。晚期肝病与病原菌和小肠细菌过度生长存在正相关，而肠道通透性的改变，引发内毒素和细菌移位进入门静脉循环，会导致免疫激活和最终的肝损伤以及全身性炎症。已有研究显示，通过饮食改变和不可吸收的抗生素(如利福昔明)治疗可以实现改善生态失调或“再生”，但在细菌多药耐药的时代，迫切需要开发不使用抗生素调节微生物群的新疗法。有趣的是，相关证据表明，不是单种优势生物对宿主健康负责，而是整个微生物群落的组成有助于平衡免疫反应。宿主发展了许多机制来平衡肠道微生物群落结构的变化。这对未来治疗方法的发展具有重要意义，这些疗法不仅仅是引入单一生物体来改善健康，它意味着我们必须确定在发生生态失调后，重新构建健康的复杂微生物组的机制，将是治疗慢性肝病的基础。因此，最终治疗可能涉及，将被视为健康的肠道微生物从非肥胖健康供体移植到患有慢性肝病的患者。已有研究显示，通过益生菌疗法或最终以FMT形式的整个微生物群移植，来实现无药物的微生物群的直接操作，可能有效缓解慢性肝病的发生发展。