阿尔茨海默病和轻度认知障碍常用实验动物模型的初步评价

于 蕾，贺晓丽

(中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种在老年人中发病率极高的神经系统退行性疾病，是继癌症、心血管疾病及脑卒中后致人类死亡的第四大病因。其症状往往随着年龄的增长而恶化，从轻度记忆障碍逐渐发展为严重的痴呆，包括语言技能的丧失、认知缺陷、视觉空间功能障碍、执行功能丧失等。AD发生具有隐匿性，按照病情发展可以被分为：无症状临床前期、轻度认知功能障碍期(mild cognitive impairment，MCI)和痴呆期。MCI诊断标准最早由美国精神科专家Petersen在1999年提出，其是指处于正常老化和痴呆的一种中间过渡状态[1]。MCI具有转化为AD的高度危险性，年转化率为10%～15%，AD患者中有2/3由MCI转化而来，是正常老年人的10倍[2-3]。目前，国际上还没有特效AD治疗药物，如果能在MCI阶段进行早期发现和有效干预，将可能会大大降低AD的发病率。

随着对AD研究的深入，MCI逐渐成为基础研究者的关注焦点。为了进行AD发病机制研究、药物筛选以及新药研发等，成功建立具有MCI特征的动物模型是必须的。但目前建立的MCI研究模型如何有效区别于AD模型仍存在着一定困难。故本综述从AD和MCI的病理特征和诊断标准入手，通过介绍常用AD和MCI实验动物模型的研究进展，从模型建立的角度对其进行总结和初步评价，为开展AD和MCI的研究提供建议。

1 AD与MCI的特征

关于AD的发病机制目前尚无定论，存在的假说有β-淀粉样蛋白异常沉积、胆碱能损伤学说、Tau蛋白过度磷酸化、氧化应激、炎症以及胰岛素信号传导通路障碍等，比较公认的是β-淀粉样蛋白异常沉积、Tau蛋白过度磷酸化和胆碱能损伤学说[4]。研究表明[1]，MCI患者的Meynert基底核区胆碱能神经元无减少，而早期AD患者减少15%。此外，MRI结果发现，MCI患者的海马和内嗅皮质的体积减少处于AD和正常老化之间，并且减少的速度高于正常老化人群[5]，MCI病人的海马结构越小，AD转化率越高[1]，因此通过MRI定量测量海马萎缩，可预测MCI转化为AD的危险性。通过VBM分析证实[6]，AD患者的灰质在海马、海马旁回、颞极、尾状核头、丘脑内侧、脑岛和杏仁核等部位发生退化，且左脑灰质体积萎缩更为显著，而MCI患者始于颞叶与额叶的灰质萎缩，导致听觉与记忆功能退化。

MCI作为AD的极早期阶段，介于正常衰老与老年痴呆的过渡状态，尚未达到痴呆程度，尸检同样发现大多数的AD和MCI患者的病理特征相似[7]，但是只在程度上有所区别。AD患者脑部萎缩更为严重，病变部位更多，主要表现为乙酰胆碱活性不足；AD患者认知功能为多领域受损，而MCI的认知功能损害可能只局限于一个或者几个认知领域。结合MCI的病理表现，MCI动物模型的理想特征应为老年、轻微的记忆受损、轻度神经病理改变、胆碱能系统改变、以及脑血管改变等，至少出现上述两种特征，即可以被合理地认为是MCI模型[8]。AD和MCI实验动物模型之间的区分标准应包括模型动物发生认知障碍的年龄，以及认知损害的严重程度[3]。

2 动物模型及造模方法

AD和MCI动物模型按产生原因大致分为两类：一是先天性动物模型，即动物本身所带有的相关病变，如代谢紊乱或特定蛋白质合成障碍等，常用的有转基因模型、基因敲除模型和快速老化小鼠等；二是后发性动物模型，人为介入物理、化学、生物等致病因素，诱发模型呈现部分或全部疾病特征，如胆碱能损伤模型、D-半乳糖模型、铝中毒模型和Aβ侧脑室注射模型等，本综述主要讨论后者。

2.1 常用AD动物模型

2.1.1胆碱能损伤模型 胆碱能神经递质是参与学习和记忆最重要的神经递质之一，乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)在中枢神经系统起着关键性作用，能特异性的作用于各类胆碱能受体。胆碱和乙酰辅酶A在ChAT的催化作用下合成ACh，进入突触间隙的ACh作用于突触后膜发挥生理作用后被AChE水解成胆碱和乙酸，从而终止胆碱能神经的信号传递，整个过程中AChE和ChAT共同维持ACh的含量和胆碱能系统的动态平衡。AD患者脑内胆碱能系统发生紊乱，ACh含量减少，是导致记忆力下降的主要原因。因此破坏动物脑内的胆碱能系统，可以重现AD胆碱能衰退的病理特征来制作AD动物模型。但该模型不出现老年斑和神经纤维缠结等AD的典型病理改变，因此多应用于胆碱能系统的机制研究及药物评价。

2.1.1.1 东莨菪碱诱导胆碱能损伤模型 东莨菪碱是M型乙酰胆碱受体竞争性阻断药，能够诱发中枢神经系统中的胆碱能神经通路及记忆环路的功能紊乱，从而导致学习记忆的严重损伤。由于东莨菪碱与突触后膜M型乙酰胆碱受体的结合是可逆的，故其阻断学习记忆的作用具有一过性特征。该模型通常采用KM、ICR或C57BL/6J小鼠，于行为学实验前15 min或30 min腹腔注射东莨菪碱1～3 mg·kg-1[9-10]。少量文献使用5 mg·kg-1剂量或0.2 mg·kg-1连续6 d。后进行跳台、避暗、穿梭箱等实验进行学习记忆行为学检测，并进行病理学检查，以评价模型是否成功。

2.1.1.2 基底前脑胆碱能神经元选择性损伤模型 兴奋性氨基酸主要存在于神经元的突触末端及各种神经细胞的细胞体和胶质细胞的细胞质中，过量的兴奋性氨基酸可能对神经细胞造成毒性作用。鹅膏蕈氨酸(Ibotenic acid，IBO)是一种含有异噁唑环的兴奋性氨基酸，具有较强的神经毒性，其与神经细胞树突上的N-甲基-D天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)受体相结合而作用于Ca2+通道，使大量Ca2+内流，造成胆碱能神经元损伤和功能丧失，引起学习记忆能力减退，乙酰胆碱含量降低以模拟AD。该模型采用SD雄性大鼠手术造模，脑部双侧注射鹅膏蕈氨酸，每侧注射时间5 min，留针5 min，缓慢起针缝合切口并肌注适量庆大霉素。对照组(假手术组)注射等量PBS或生理盐水。造模14 d后，通过行为学实验及病理学检查以确定模型是否成功[11-12]。

2.1.2Aβ损伤模型 AD的病理特征主要为脑内淀粉样斑块沉积、神经元丢失及神经纤维缠结形成。正常生理情况下人体中的β-淀粉样前体蛋白降解均会产生少量的Aβ40和Aβ42，其以可溶性、低浓度形式存在于脑脊液和血浆中，并不会产生神经毒性。病理状态下，Aβ42含量升高且Aβ42更易聚集形成淀粉样蛋白，是形成老年斑的主要成分，提示它在AD发病机制中占有更重要的作用。Aβ诱导的AD动物模型，一般采用雄性ICR小鼠或雄性Wistar大鼠，将人工合成的Aβ在微渗透泵的推动下注射入动物的侧脑室或海马组织中，模拟Aβ对中枢神经的毒性[13-14]。

2.1.3冈田酸(OA)致Tau蛋白损伤模型 Tau蛋白属于微管相关蛋白(MAPs)家族，于1975年被发现且被鉴定为细胞骨架中装配和稳定微管的必需成分,主要存在于细胞轴突。Tau蛋白的错误折叠和病理改变是神经系统退行性疾病的基础，高度磷酸化的Tau蛋白因为结构的改变可以形成寡聚体，寡聚体进一步形成具有双螺旋纽带结构的成对螺旋丝(PHFs)。PHFs进一步形成神经纤维缠结，从而导致突触消失，认知能力下降。冈田酸是一种磷酸酯酶抑制剂，可以快速的代谢进而改变体内磷酸化-去磷酸化速率。通常采用Wistar雄性大鼠，向其侧脑室微泵注入磷酸酯酶抑制剂，使磷酸化的Tau蛋白呈现双螺旋细丝状的病理改变，从而导致β-淀粉样蛋白沉积和随后的神经元变性、突触损失和记忆障碍[15]。

2.1.4D-半乳糖(D-gal)模型 D-gal是人体中的一种还原性糖，可以在正常生理浓度下代谢为葡萄糖。但是在高浓度下，D-gal在醛糖还原酶的作用下生成半乳糖醇，半乳糖醇继而被激活后的半乳糖脱氢酶氧化，生成氧化产物过氧化氢和醛，这一过程共产生3种活性氧自由基(ROS)，过量的ROS进一步攻击细胞，引起神经元细胞的损伤，从而动物出现学习记忆障碍和机体衰老等特征。文献报道[16]通过检索1996～2007年CNKI和NCBI文献，D-Gal致衰老模型鼠主要有KM、ICR或BALB/C小鼠，其中KM小鼠所占比例为0.797。D-Gal造模方法主要为颈背部皮下注射或腹腔注射，而颈背部皮下注射占比约为0.824。D-Gal常用浓度为50～500 mg·kg-1不等，其中100～150 mg·kg-1所占比例为0.488。我们通过NCBI筛查近5年英文文献，发现模型鼠以昆明鼠、ICR、BALB/C居多，D-gal剂量在100～150 mg·kg-1造模时间为8～10周，而D-gal剂量在500 mg·kg-1造模时间为5～6周，给药方式均为生理盐水溶解后颈背部皮下注射[17-18]。

2.1.5铝中毒模型 铝是自然界分布极其广泛的一种金属，一般以化合态存在，有研究表明高水平的铝会增加某些神经退行性疾病的风险，包括透析性脑病、AD和帕金森病(PD)等。动物实验表明铝会导致神经病理、神经行为、神经化学的改变从而导致记忆能力损伤。铝中毒模型一般采用连续或间隔灌胃AlCl3溶液10～500 mg·kg-16～12周，大鼠通常使用Wistar大鼠，小鼠可使用KM或者ICR小鼠[19-20]。

2.2 常用MCI动物模型AD在临床上治疗效果不佳的主要原因之一是干预时机太晚，在诊断出痴呆时记忆已经发生不可逆转性损害，同时伴随有大量神经元凋亡。因此一些学者提出，应当把干预时间前移，即在MCI阶段介入治疗。对MCI的干预目的是为了预防、延缓甚至是扭转其向AD转化的进程。针对这一目的的干预措施分为：临床手段和非临床手段。而由于提出MCI这个概念时间尚短和其本身的不确定性，非临床研究开展的较少。

以轻度认知障碍为主题词合并关键词动物在CNKI检索，共有69条结果，有效文章5篇。以Mild cognitive impairment为主题词合并Animal在NCBI检索，共有72条结果，有效文章1篇。再以轻度认知障碍和Mild cognitive impairment分别在CNKI和NCBI对检索结果进行复筛，发现动物轻度认知障碍模型主要包括姚明江等[21]以大鼠颈背部皮下连续5～10周注射D-半乳糖50 mg·kg-1，后高脂饲料喂养2～5周构建的老年轻度认知障碍模型。徐世军等[22]使用KM小鼠，行为学实验前30 min前腹腔注射东莨菪碱2 mg·kg-1造模。

在基础研究方面，AD实验动物模型有多种类型，MCI研究模型应区别于AD模型。原则上AD的动物模型在早期时，可以模拟轻度认知障碍，如已经报道的先天性动物模型，包括转基因鼠和老化鼠等[3,23]。但是本文主要讨论后发性动物模型，即上述由人为介入物理、化学、生物等致病因素而造成的模型。而以上实验中报道的MCI模型无论是在造模周期、给药剂量、还是给药方式上与AD模型都没有显著的差异，同时在实验中也没有明确给出判断为MCI的指标或标准。毋庸置疑的是在上述模型中一定存在MCI阶段，但是在现阶段还无法准确判断其发生的具体时间。

3 评价

通过模型总结发现：胆碱能神经元选择性损伤诱导的痴呆模型可以模拟人大脑皮层、海马等脑区胆碱能神经系统损害和记忆认知行为的改变，造模时间短，价格便宜，但该模型存在一定的弊端：东莨菪碱引起的胆碱能功能损害是可逆的，具有一过性特征；IBO所诱导的痴呆仅模拟了与认知功能有关的胆碱能神经系统损害相关的信息，并有可能损害邻近注射部位的非胆碱能神经元。Aβ/冈田酸注射模型模拟了痴呆的认知功能障碍和某些病理改变，具有操作简单、时程短、成本低等优点，适用于抗痴呆药物筛选研究。但应注意在脑部导入Aβ/冈田酸的同时动物都有一定的局灶型损伤，且大量Aβ或冈田酸弥散分布到脑是该模型所需要解决的问题，并且动物体内存在Aβ清除机制，因此模型很难达到满意的效果。另外，脑内注射Aβ/冈田酸是一种急性单因素模型，不符合AD慢性起病的特点。D-gal致衰老模型在造模过程中表现出接近自然老化的生理特点，出现学习与记忆能力减退、海马锥体细胞减少、病理细胞增多等现象。又因为其价格低、操作方便、重复性高等特点，广泛用于AD和MCI的D-gal致衰老模型，同时也可以与其他造模方式联合起来制作需要的模型。但其对氧化机制的阐释与AD经典病理特征的呈现仍有不足。铝损伤模型模拟了AD胆碱能神经系统功能下降及记忆力减退的特征，但此模型形成的神经纤维缠结中Tau蛋白没有磷酸化成PHF，中枢胆碱能活性正常，而且造模周期较长。

现今已经有很多实验室采用复合方法造模。罗焕敏等[24]采用D-gal合并AlCl3成功制备符合发病特征的AD模型；曾芳等[25]在腹腔注射D-gal的基础上，采用侧脑室注射Aβ，该模型体现了Aβ沉积和记忆功能损害等AD主要的病理学特征。采用复合多因素模型，更符合痴呆病症的多靶点特征，有可能在抗痴呆领域得到更为广泛的应用。

对于AD或者MCI，临床诊断方法包括生物标志物检测、神经心理学评估量表、基因检测、影像学检查等，并分别制定了详细的诊断和治疗指南。在基础研究方面，由于动物实验的局限性以及可行性问题，即使每年发表大量AD的研究文章，但是缺少明确的评价指标来判断究竟模型是AD模型还是MCI模型。所以在已发表文章中针对基础研究的MCI阶段，存在两个疑虑，其一：MCI模型是否造模成功；其二：如何认定所建立的模型是AD还是MCI模型。

4 结语

AD由于其疾病本身的复杂性，单一造模存在很大弊端，越来越多的研究趋向于复合造模，目前为止，尚无对复合造模效果的比较研究，由于AD和MCI的发病机制不够明确，且猜想靶点和致病因素较多，世界范围内目前未发现能够全面再现人AD、MCI病理特征的动物模型。但多数学者认为，采用复合方法造模能在很大程度上表现出更为接近AD或MCI特征的模型动物，为痴呆的研究提出了更深入的探索方向。迄今为止没有公认的AD或MCI动物模型，研究者只能从药物和疾病本身的特征出发，选择匹配度较高的模型用于研究。一般而言，基础研究的药效评价多数依赖于动物指标，所以模型的选择、模型成功与否、能否精准造模以符合疾病特征等是实验过程中我们需要慎重考虑的问题。

致谢：本综述在中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所完成，指导老师贺晓丽老师。