基于数据挖掘分析蒙药忠伦-5治疗类风湿关节炎的作用机制

付旭阳，高 丽，吕 宏，侯秋丽，陈金双，孔令雷，石瑞丽

(1.包头医学院生理学教研室，内蒙古 包头 014040； 2.包头医学院神经科学研究所，内蒙古 包头 014040；3.山西大学中医药现代研究中心，山西 太原 030006； 4.广东省人民医院麻醉科，广东省 广州市 510080；5.内蒙古监狱管理局第一医院麻醉科，内蒙古 呼和浩特市 010000； 6.包头医学院麻醉学院，内蒙古 包头 014040;7.中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所，北京市药物靶标研究与药物筛选重点实验室，北京 100050)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是病因尚未明确的、以侵蚀关节为主的全身性免疫疾病。临床表现为对称性多关节炎及关节外病理性改变，逐渐出现骨组织的破坏与侵蚀，导致关节不同程度的畸形。患者需要长期服药，药物的副作用及经济负担严重影响患者的生活质量。

蒙药复方忠伦-5，别名合日呼-5汤、忠伦阿汤等，由苦参(SophoraFlavescensAit，SFA)、栀子(GardeniajasminoidesEllis，GJE)、川楝子(FructusToosendan，FT)、诃子(TerminaliachebulaRetz，TCR)、肋柱花(Lomatogoniumrotatum，LR)组成，出自蒙医著作《观者之喜》，具有清热凉血、舒筋止痛功效，是蒙医治疗热性黄水病、游痛证、痛风、陈旧热等疾病的常用方剂，传统蒙医临床应用本方治疗RA[1]，能够明显改善RA患者的生活质量，疗效明确[2]。动物试验中，忠伦-5对小鼠急性、亚急性和慢性炎症，均有减轻炎性细胞因子对关节的刺激作用[3]。

作为“非物质文化遗产”的蒙医学，经过长时间的发展，形成了一个全面而独特的医学体系。然而，从分子水平来理解蒙药方剂仍然是一大挑战。随着生物信息学、系统生物学和多向药理学的飞速发展，“网络药理学”概念被提出，基于网络的药物研发成为一种新的高效可行的方法。通过网络桥接药物和疾病，多方向、多角度地阐述药物治疗疾病的机制。已有研究证实了该方法的可行性[4-5]。为全面阐释蒙药忠伦-5的作用机制，本课题拟应用网络药理学方法全面地解析忠伦-5治疗RA的机制，为传统蒙药的研发提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 忠伦-5成分信息及作用靶点的获取登录TCMSP数据库[6](http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php，Version：2.3)和TCMID数据库[7](http://www.megabionet.org/tcmid/，Version：2.0)获得苦参、诃子、栀子、川楝子、肋柱花化合物信息，并以“经口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18”为条件筛选化合物。将化合物的2D分子结构式输入到Swisstarget prediction数据库[8](http://www.swisstargetprediction.ch)中，预测化合物的作用靶点，保存靶点uniprot ID和名称等信息。

1.2 RA相关靶点的获得在DISGENET数据库[9](http://www.disgenet.org/，version 5.0)中，以“Rheumatoid arthritis”为关键词，检索与RA相关的靶点。删除重复靶点并剔除相关性得分小于0.3的靶点，保留剩余靶点，与上述的忠伦-5靶点相匹配，得到忠伦-5治疗RA的作用靶点数据集。

1.3 VENNY图的制作登录Draw Venn Diagram网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)将各单味药及靶点输入在表格中，得到VENNY图，找到5种成分共同作用的靶点。

1.4 蛋白-蛋白相关作用网路构建分析将数据集的靶点信息导入STRING数据库[10](https://string-db.org/，Version 10.5)，种属选择“Homo sapiens”，获得靶点间的蛋白-蛋白相互作用网络，下载相关数据并导入Cytoscape(Version:3.2.1)软件中，构建网络、拓扑分析，根据自由度设置节点颜色及大小，构建为蛋白-蛋白相互作用网络。

1.5 生物功能分析及参与通路获得将忠伦-5治疗类风湿关节炎作用的靶点uniprot ID导入Cytoscape软件的GO插件(Version:2.3.5)中，设置物种“Homo sapiens”选择“GO分析、参与生物过程分析及KEGG通路分析”设置P值<0.05，提交获得相关结果。

1.6 Hub节点选择及分子对接验证应用Cytoscape软件的cytoHubba插件，cytoHubba应用Maximal Clique Centrality(MCC)方法，综合11个拓扑分析方法(Degree，Edge Percolated Component，Maximum Neighborhood Component，Densityof Maximum Neighborhood Component，Maximal Clique Centrality)和6个中心性方法(Bottleneck，EcCentricity，Closeness，Radiality，Betweenness，and Stress)，选择关键靶点，找到作用于关键靶点的活性成分，将成分及应对的关键靶点输入Systems Dock Web Site (http://systemsdock.unit.oist.jp，Version 2.0)进行分子对接，保存结果，根据对接得分分析活性成分与各靶点间的结合活性。

2 结果

2.1 靶点预测通过TCMSP和TCMID数据集得到忠伦-5的潜在靶点，并将这些靶点与DISGENET数据库中RA的靶点进行对比，交集为治疗RA的靶点，通过用uniprot ID获得靶点全称及简写，按“uniprot ID”及DisGeNET数据库给出的“Probability”数值排序，得到忠伦-5治疗RA的潜在靶点90个(Tab 1)。

Tab 1 Potential targets of Zhonglun-5 in treatment of rheumatoid arthritis

续表1

2.2 VENNY图的制作为获得5味药的共同作用靶点，通过VENNY图对结果进行可视化，将各味药及相应的靶点通过Venn diagram网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)制作VENNY图，发现雌激素受体β(estrogen receptor beta，ESR2)、细胞色素P450 19A1(cytochrome P450 19A1，CYP19A1)、雄激素受体(Androgen receptor，AR)、雌激素受体(Estrogen receptor，ESR1)靶点为5种单味药共同作用的靶点，且较多作为共同靶点出现(Fig1)。

Fig 1 Different colors represented different herbs.

2.3 蛋白-蛋白相互作用网络的构建与分析考虑到疾病靶点和其它蛋白的相互作用，为全面阐释靶点机制，将上述数据集的靶点及已有实验证明的靶点肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)及白介素6(interleukin-6，IL-6)通过STRING数据库获得蛋白-蛋白相互作用信息[3]，下载数据导入Cytoscape软件进行可视化处理及拓扑分析，根据自由度设置节点颜色及大小，得到网络图(Fig 2)。图中蛋白节点92个，边754个。节点颜色由白到黄，颜色越深，节点自由度越高，节点大小由自由度决定，节点自由度越高节点越大。内圈为自由度排序为前30的节点。

2.4 GO插件分析结果通过Cytoscape中的GO插件对数据集中的靶点进行参与生物过程分析及KEGG通路分析。生物过程分析结果表明，靶点主要富集于对活性氧的反应(response to reactive oxygen species)、破骨细胞分化(osteoclast differentiation)、糖皮质激素生物合成过程(glucocorticoid biosynthetic process)、凋亡信号通路的正调节(positive regulation of apoptotic signaling pathway)、等多种生物过程中(Fig 3)，图中Y轴为生物过程名称，X轴为靶点在生物过程中的比例，各节点颜色代表P值，节点大小代表参与生物过程的靶点数；KEGG结果表明靶点参与的信号通路包括类固醇激素生物合成(steroid hormone biosynthesis)、花生四烯酸代谢(arachidonic acid metabolism)、氮代谢(nitrogen metabolism)、ABC转运器(ABC transporters)、PPAR信号通路(PPAR signaling pathway)等43条通路。将靶点参与通路信息导入到Cytoscape软件中得到“靶点-通路”图(Fig 4)，图中以自由度设置节点大小，橙色通路，蓝色为靶点，节点109个，边341个，节点平均自由度为5.927。

Fig 2 Target protein interaction network of Zhonglun-5

2.5 Hub节点选择及分子对接验证将上述建立的“靶点-通路”图导入Cytoscape软件中，运行cytoHubba插件，对这些节点进行排序，选取排名前8的关键靶点(得分大于10)，分别为丝裂原活化蛋白激酶9(mitogen-activated protein kinase 9，MAPK9)、丝裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)、RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，Akt1)、丝裂原活化蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14)、信号转导和转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)、信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)和凋亡调节因子Bcl-2。找到与靶点对应的活性成分包括番红花酸(crocetin)、玫瑰树碱(ellipticine)、水麦冬甙(triglochinin_qt)、8-异戊烯基-山奈酚(8-首先通过数据库获得了90个蒙药忠伦-5抗RA的靶点，并通过STRING数据库，获得了这些靶点的相互作用关系，其中Akt1、IL-6、TNF、前列腺素G/H合成酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)、EGFR及基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP9)等与多种蛋白存在联系，这些结果与前期研究结果一致，证明了本次研究的科学性和可靠性。蛋白-蛋白相互作用结果证明这些靶点并非单独起效，而是通过相关的作用关系、相互联系isopentenyl-kaempferol)、5,7,4'三羟基-6-异戊烯基异黄酮(wighteone)、刺芒柄花素(formononetin)、苦楝子酮(melianone)、槲皮素(quercetin)和皮树脂醇(40957-99-1)，应用Systems Dock进行分子对接，结果如下(Fig 5)，图中颜色越深得分越高(最高值为8.416)。

Fig 3 Gene ontology terms for biological process of Zhonglun-5

Fig 4 Target-pathways

3 讨论

Fig 5 Results of molecular docking

而产生效应。随后我们通过网络分析，发现忠伦-5主要参与氧化应激、内皮细胞增殖、糖皮质激素合成代谢、骨代谢、炎症及凋亡等生物过程作为主要途径作用于RA，反映出忠伦-5是多途径的作用特点。在KEGG通路分析中，发现靶点参与的ras信号通路、PPAR信号通路、erbb信号通路、自噬相关通路、JAK-STAT信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、雌激素信号通路、IL-17信号通路均与RA密切相关。分析靶点-通路图，得到蒙药忠伦-5治疗RA的Hub节点：MAPK9、MAPK8、Akt1、MAPK14、STAT1、STAT3、EGFR和Bcl-2，找到的活性成分包括番红花酸、玫瑰树碱、水麦冬甙、8-异戊烯基-山奈酚、5,7,4'三羟基-6-异戊烯基异黄酮、刺芒柄花素、苦楝子酮、槲皮素和皮树脂醇，最后通过分子对接确定了活性成分与靶点的结合活性，发现活性成分中番红花酸不能与关键靶点结合，但番红花酸可以与其他RA相关靶点结合，且有较多研究证实其具有抗炎作用，因此番红花酸可作为活性成分存在。靶点中的EGFR与活性成分的结合能力较低，其它靶点均可与活性成分结合。

Hub节点中MAPK8、MAPK9、MAPK14为MAPK家族成员，MAPK作为重要的信号转导通路，参与细胞的多种生物过程，且已有以MAPK作为治疗靶点的成功案例。MAPK14是p38的α亚型，其参与的p38-MAPK通路与RA发病机制中的炎症密切相关，活化的p38通过激活下游蛋白，间接影响基因表达。有实验证实[11]，在RA滑膜组织中，炎性因子等因素刺激使T细胞的p38异常活化，抑制肿瘤坏死因子受体超家族成员6(tumor necrosis factor receptor superfamily member 6，Fas)诱导的细胞凋亡，使组织中的炎症持续存在；p38还能导致炎性因子、趋化因子的基因过度表达，进一步促进RA的滑膜细胞炎症的发展。MAPK8和MAPK9是JNK的1/2亚型，JNK通路被认为与RA相关，当JNK和JNK上游的蛋白磷酸化被抑制时，基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase-1，MMP1)、基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase-13，MMP13)表达都被降低[12]，而MMP-1和MMP-13是介导软骨破坏的关键蛋白。Akt1是蛋白激酶B，现有研究中，Akt主要通过PI3 Kinase-Akt经典信号途径参与RA的发病，PI3 K/Akt通路通过激活各种下游靶蛋白，产生不同的生物效应[13]，且PI3 K/Akt/mTOR通路能够调节自噬，为RA的研究热点。STAT1和STAT3为信号转导子和转录激活子，在RA纤维样滑膜细胞增殖及炎症反应中均有影响[14]，此外JAK/STAT信号通路通过诱导基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)基因的表达[15]，参与软骨的破坏中。有关忠伦-5与MMPs表达的研究已有证实，但对上游的STAT的影响，还需进一步研究。Bcl-2是与凋亡密切相关的基因，具有抗凋亡和延长细胞生命的作用。上述很多靶点及通路都作用于Bcl-2，产生相应的生物学效应。本研究发现，Bcl-2作为诃子和川楝子共同的靶点，参与多种生物过程及信号通路，并且可能以抗凋亡的作用干预疾病的发展，具有一定的研究价值。

最终我们确定了忠伦-5治疗类风湿关节炎的主要靶点MAPK9、MAPK8、Akt1、MAPK14、STAT1、STAT3、EGFR和Bcl-2，活性成分有玫瑰树碱、水麦冬甙、8-异戊烯基-山奈酚、5,7,4'三羟基-6-异戊烯基异黄酮、刺芒柄花素、苦楝子酮、槲皮素和皮树脂醇，本研究发现蒙药忠伦-5主要通过MAPK通路、P13 K/Akt通路、JAK-STAT通路以及一些炎性因子发挥治疗RA的作用。有关忠伦-5在RA中的抗炎作用既往已有一些报道，反映了本研究结果的可靠性，其它靶点及通路可作为后续研究的理论基础。本研究较为全面地阐述了经典蒙药复方忠伦-5治疗RA的靶点及其信号转导通路，为临床应用该方提供了更多的理论依据，也为今后深入地研究忠伦-5的药理作用机制提供了新的线索。