TNF-α对颌骨骨髓间充质与牙周膜两种干细胞自噬水平的影响

王 璞 韦丽宾 倪广晓 廉云敏 高 岚

牙周组织缺损为临床常见口腔疾病，该病治疗中牙周组织工程发挥重要作用，治疗关键为选择恰当种子细胞。牙周膜干细胞（PDLSCs）是一种多能干细胞，有自我更新、多向分化潜能，可在不同诱导条件下向软骨细胞、骨细胞等分化，为牙周组织缺损修复理想材料[1]。颌骨骨髓间充质干细胞（JBMMSCs）具有多向分化、增殖潜能，且可调节免疫力，免疫排斥反应小，在牙周组织再生修复发挥重要作用[2，3]。近年来，临床开始越来越多地关注来源于炎症组织的细胞，为PDLSCs、JBMMSCs 取材探寻新途径。自噬属于机体内维持细胞内环境稳定的自我保护机制，可实现细胞自身代谢需求及部分细胞器更新需要，且与细胞凋亡密切相关[4]。本研究重点探讨肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对PDLSCs、JBMMSCs 自噬水平的影响，报道如下。

资料和方法

一、一般资料

Sigma 公司提供的Ⅰ型胶原酶、Olympus 公司提供的一步法逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒、Applied Biosystem 公司提供的RT-PCR 仪、Gibco公司提供的α-MEM 培养基、杭州四季青生物工程材料有限公司的胎牛血清、Abcam 公司提供的鼠抗P62、Santa Cruz Biotechnology 公司提供的兔抗LC3、Qiagen公司提供的DNA 提取试剂盒、Eppendorf 公司提供的紫外线分光光度仪、Beckman Coulte 公司提供的流式细胞仪、BIO-TEK 公司提供的酶联免疫检测仪等。

二、研究方法

1.人JBMMSCs 分离、纯化、培养：收集本院15例埋伏阻生智齿拔除患者（12～18 岁）需去除骨阻力时获得的颌骨骨碎片，且患者知情同意，置于预冷α-MEM 培养液。PBS 液内漂洗骨碎片，2～3 次。骨髓腔以PBS 液冲洗，持续3 次。收集吹出的骨髓基质细胞、骨碎片。3000r/min 离心，持续15min，得细胞沉淀、骨碎片。细胞沉淀以α-MEM 培养基（含10%FBS）均匀吹散，连同骨碎片接种到6 孔培养板，静置培养。细胞铺满6 孔板80%，以0.25%胰蛋白酶消化，传代，标记（第一代）。以有限稀释法对细胞进行克隆分离、纯化细胞，扩增至1×107数量级。

2.人PDLSCs 分离、纯化、培养：收集本院15 例行正畸治疗患者（12～18 岁）拔除的健康第一前磨牙，且患者知情同意。取材后置于预冷α-MEM 培养液。牙齿以PBS 液反复冲洗，刮取根中1/3 区域牙周膜组织，修剪为组织块（大小1mm3）。3000r/min 离心，15min。弃上清液，避光，以1mLⅠ型胶原酶滴入，37℃孵箱消化，15min。3000r/min 离心，15min。于6孔板上平铺组织块，覆盖以无菌盖玻片，以1-2mLα-MEM 培养液（含10%胎牛血清）滴入。观察细胞铺满6 孔板底约80%，以0.25%胰蛋白酶消化，传代，标记（第一代）。以有限稀释法对细胞进行克隆分离、纯化细胞，扩增至1×107数量级。

3.细胞凋亡检测：收集生长良好的第三代人JBMMSCs、PDLSCs，接种于6 孔板（2×105个/孔），分别以0、20、50、100ng/mL TNF-α 作用于细胞，持续3d。收取各组细胞，以PBS 液冲洗2 次。1000r/min离心，5min，弃上清液。以PBS 液（含3% FBS）重悬细胞，吹匀，制作单细胞悬液，确保各Ep 管内细胞数量＞5×105个。凋亡情况以流式细胞仪检测。

4.收取不同浓度TNF-α 作用3d 的细胞，以TRIzol 一步法提取总RNA，实施完整性检测，RNA浓度以酶标仪检测，并合成cDNA。于CFX96TM实时定量PCR 仪中扩增、检测。Western blot 检测时，收取不同浓度TNF-α 作用3d 的细胞，预冷PBS 液清洗，持续3 次，弃PBS。各孔加入200μL 细胞裂解液PIPA（含1mmol/L 蛋白酶抑制剂PMSF），吹匀，提取细胞总蛋白，蛋白浓度以G250 法检测。混合蛋白样本、上样缓冲液，置于100℃水中，持续5min，置于-80℃冰箱内备用。制备SDS-PAGE 胶，取出，转膜，冰浴，200mA 恒流转膜，持续2h。蛋白样本转移至PVDF 膜。PVDF 膜置于5% BSA 中，室温下封闭，持续2h。一抗滴入，4℃下过夜，次日复温1h，TBST 洗膜，10min/次，共3 次。等量混合SuperSignal West Pico 发光液A 液、B 液，滴在PVDF 膜目的条带处，凝胶成像系统曝光成像。

三、观察指标

观察TNF-α 不同浓度对细胞凋亡的影响；观察TNF-α 作用后细胞自噬、凋亡的短期、长期变化。

四、统计学分析

以SPSS20.0 软件分析。连续变量进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，以t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

不同浓度TNF-α 作用3d 时，JBMMSCs、PDLSCs 在20、50ng/mL TNF-α 下几乎不发生凋亡，与0ng/mL 时差异无统计学意义（P＞0.05）；JBMMSCs、PDLSCs 在100ng/mL TNF-α 下细胞凋亡增加，高于20、50ng/mL，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

图1 TNF-α 作用1d 后细胞自噬、凋亡变化。其中A’、A 分别为PDLSCs 的对照组与TNF-α 实验组；B’、B 分别为JBMMSCs 的对照组与TNF-α 实验组

图2 TNF-α 作用7d 后细胞自噬、凋亡变化。其中A’、A 分别为PDLSCs 的对照组与TNF-α 实验组；B’ 、B 分别为JBMMSCs 的对照组与TNF-α 实验组

JBMMSCs、PDLSCs 经TNF-α 作用1d 后，自噬相关基因LC3 表达升高，泛素化蛋白P62 表达降低，凋亡相关蛋白Bcl-2 表达升高，如图1。JBMMSCs、PDLSCs 经TNF-α 作用7d 后，自噬相关基因LC3 表达降低，泛素化蛋白P62 表达升高，凋亡相关蛋白Bcl-2 表达下降，如图2。

表1 TNF-α 不同浓度下JBMMSCs、PDLSCs 目的基因相对表达量（±s）

表1 TNF-α 不同浓度下JBMMSCs、PDLSCs 目的基因相对表达量（±s）

TNF-α 浓度0ng/mL 20ng/mL 50ng/mL 100ng/mL F P JBMMSCs 1.01±0.02 1.02±0.04 1.02±0.03 1.49±0.11 226.952 0.000 PDLSCs 1.01±0.01 1.02±0.02 1.02±0.02 1.48±0.12 208.816 0.000

讨论

牙周组织缺损在临床上较为常见，属于多发口腔炎症性疾病，其治疗核心为修复牙周缺损骨质[5]。干细胞增殖、分化在牙周组织缺损修复中发挥重要作用，特别是JBMMSCs、PDLSCs，在这一过程中扮演重要角色[6，7]。JBMMSCs、PDLSCs 具有取材方便、损伤小、无免疫排斥反应等特点，为优秀的组织工程种子细胞，可有效修复缺损关节软骨[8]。近年来，研究报道微炎症环境可抑制JBMMSCs 再生能力，影响干细胞移植效果，但其具体调控机制仍不完全清楚[9]。TNF-α 为常见炎性因子，其水平变化与炎症程度呈正相关[10]。动物学实验发现，10～1000ng/mL TNF-α 可促进大鼠BMSCs 增殖,且随TNF-α 浓度增加，大鼠BMSCs 分泌促炎因子IL-6 能力降低，分泌抑炎因子IL-10 的能力升高[11]。研究发现，体内微炎症环境可诱导PDLSCs 自噬，经由调控细胞自噬水平，增强对疾病的治疗效果[12]。

本研究自表1 可以看出，TNF-α 作用3d 时，JBMMSCs、PDLSCs 在20ng/mL、50ng/mL TNF-α 下几乎不发生凋亡，而TNF-α 浓度增加至100ng/mL时，JBMMSCs、PDLSCs 细胞凋亡明显增加，且较20、50ng/mL 差异显著。这说明TNF-α 浓度增加至100ng/mL，可提升细胞凋亡发生风险，100ng/mL 考虑可作为TNF-α 短时间内不使细胞出现凋亡的最大浓度应用于临床。本研究中，自图1、图2 可以发现，JBMMSCs、PDLSCs 经TNF-α 作用1d 后，自噬相关基因LC3 表达升高，泛素化蛋白P62 表达降低，凋亡相关蛋白Bcl-2 表达升高，说明TNF-α 短期作用可激活JBMMSCs、PDLSCs 自噬，降低细胞凋亡水平。而TNF-α 作用7d 后，JBMMSCs、PDLSCs自噬相关基因LC3 表达降低，泛素化蛋白P62 表达升高，凋亡相关蛋白Bcl-2 表达下降，说明TNF-α长期作用可导致JBMMSCs、PDLSCs 长期处于炎性微环境中，使得细胞自噬现象逐渐消失，诱导细胞凋亡。此外，本研究还发现，JBMMSCs、PDLSCs 自噬、凋亡呈负相关，随着自噬水平提升，其细胞凋亡下降，而自噬水平降低，细胞凋亡增高。这说明临床采取积极措施激活JBMMSCs、PDLSCs 自噬水平，可有效预防细胞凋亡，使得JBMMSCs、PDLSCs 更好发挥功能。