液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中20种酸性除草剂残留

黄 科， 张建莹， 邓慧芬， 洪旭然， 李 凯

(深圳海关食品检验检疫技术中心，广东深圳 518045)

酸性除草剂多用于小麦、水稻等的杂草防治，但其极易溶解于地表水中，可对人类和生物体造成严重危害。典型的酸性除草剂有苯氧羧酸类、芳氧苯氧丙酸酯类、吡啶氧羧酸类等。该类除草剂以2,4-滴最为著名，其他常用酸性除草剂如麦草畏、吡氟禾草灵、氟吡禾灵、2甲4氯、二氯吡啶酸均为2,4-滴优化而来[2]。我国对2,4-滴、氟吡禾灵、高效氟吡甲禾灵等在蔬菜上均有限量要求[3]，分别为0.05～0.5、0.2、0.1～0.2 mg/kg。4-氯苯氧乙酸禁止在豆芽生产中使用。但是更多的酸性除草剂在蔬菜上并无限量要求。然而日本、欧盟对除草剂的使用要求却较为严格，大多酸性农药均有限量要求。日本和欧盟要求2甲4氯在蔬菜上的限量为0.1、0.05～0.1 mg/kg，氯氟吡氧乙酸在蔬菜上的限量为0.04～0.05、0.05 mg/kg。因此，建立实用高效的酸性除草剂多残留检测方法尤为重要，可为蔬菜安全监测及限量制定提供参考。

目前,针对酸性除草剂在不同基质中的检测方法主要有气相色谱法(GC)[4 - 5]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[6 - 7]、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)[8]、液相色谱法(LC)[9]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[10 - 11]和毛细管电泳法(CE)[12]等。其中,LC-MS/MS法因具有灵敏度高、定性定量准确、可实现复杂基质中多种痕量物质测定等优点,在农药残留检测方面应用广泛。QuEChERS方法步骤少，试剂消耗少，目标化合物损失少，适用农药范围广，是多残留分析的前处理首选方法。本研究对常用的苯氧羧酸类、芳氧苯氧丙酸酯类、吡啶氧羧酸类等几大类酸性除草剂，选取其中最典型的，如：2,4-滴、麦草畏、氟吡禾灵、溴苯腈、双草醚、二氯吡啶酸等20种化合物为研究对象，通过优化QuEChERS方法，建立液相色谱-串联质谱定性及定量方法。该方法的建立，可以满足日常检测及筛查蔬菜中酸性除草剂工作，具有实用意义。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

8050液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(日本，Shimadzu公司)；均质仪(美国，Omni公司)；旋涡振荡仪(德国，Heidolph公司)；往复震荡仪(日本，Yamato公司)；高速冷冻离心机(德国，Sigma公司)。

20种酸性除草剂标准品，纯度≥95%(德国Dr.E公司)。根据标准品的溶解度选用甲醇溶剂配制浓度为1 000 mg/L的各个农药标准储备液，再移取适量单储备液使用甲醇配制成10 mg/L的混合标准溶液于-30 ℃避光存放。甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯(德国Merck公司)；无水MgSO4、NaCl均为分析纯(成都市科龙化工试剂厂)；石墨化炭黑(GCB)、N-丙基乙二胺(PSA)(美国Supelco公司)。水为Milli-Q(美国Millipore公司高纯水发生器制备)超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理称取10.0 g(精确至0.01 g)蔬菜样品于50 mL具塞离心管中，加入10 mL 0.5%甲酸乙腈(V/V)，在28 000 r/min下均质1 min，加入4.0 g MgSO4，1.0 g NaCl，加盖迅速摇匀，振荡提取5 min，9 500 r/min 离心5 min。上清液待净化。

1.2.2 样品净化取6 mL上清液，移入含900 mg MgSO4，50 mg GCB吸附剂的15 mL具塞离心管中，摇匀后，振荡3 min，以9 500 r/min 离心5 min。取上清液1 mL，经0.22 μm有机滤膜过滤后，供LC-MS/MS测定。

1.3 色谱-质谱条件

色谱柱：Poroshell 120 EC-C18柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm；美国Agilent公司)。流动相A为0.01%甲酸水溶液(V/V)，流动相B为甲醇。梯度洗脱程序：0～1.00 min，5%B；1.00～2.00 min，5%～50%B；2.00～6.00 min，50%～100%B；6.00～6.10 min，100%～5%B；6.10～9.00 min，5%B。流速：0.3 mL/min。柱温40 ℃；进样量2 μL。离子源：电喷雾离子源(ESI)。扫描方式：正负离子扫描。离子源温度：300 ℃。雾化气流速：3.0 L/min。干燥气流速：10.0 L/min。脱溶剂管温度:200 ℃。加热模块温度：400 ℃。加热气流速：10.0 L/min。离子源电压：4.0 kV。采用分段多反应监测(MRM)模式检测。分辨率：单位分辨率。驻留时间：30 ms。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

选择水-甲醇、水-乙腈、5 mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.01%甲酸水溶液-甲醇、0.01%甲酸水溶液-乙腈作为流动相进行比较，发现选用0.01%甲酸水溶液-甲醇、0.01%甲酸水溶液-乙腈作为流动相时，目标化合物离子化效果都较好，响应信号都较强。鉴于甲醇价格较乙腈更便宜，故最终选择0.01%甲酸水溶液甲醇作为流动相[13 - 14]。20种化合物的MRM总离子流色谱图见图1。

图1 20种化合物在MRM模式下的总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatogram of a standard solution of 20 compounds in MRM mode

2.2 质谱条件优化

在电喷雾离子源正负离子模式下，先对各农药目标物的单标准溶液进行全扫描，获得稳定的母离子，选择离子监测模式优化碎裂电压；再进行子离子扫描，每个目标物选取2对响应值高的特征离子对作为定量、定性离子对，进一步优化碰撞能量。由于麦草畏、4-氯苯氧乙酸、2甲4氯、2,4-滴丙酸、2甲4氯丙酸、2,4,5-涕、2,4-滴丁酸、2甲4氯丁酸、2,4,5-涕丙酸、三氯吡氧乙酸等农药的二级碎片离子除了[M-RCOOH]-响应都偏低，故选氯的同位素准分子离子[M+2-H]-和[M+2-RCOOH]-作为另外一对监测离子对[15 - 16]。优化结果见表1。

2.3 前处理方法的优化

2.3.1 提取溶剂的选择考察的20种酸性除草剂大多在碱性条件下易离解成盐而溶于水相中，故可向样品中加入适量的酸来抑制其解离，从而增强酸性农药在有机相中的分配比例。分别用0.2%甲酸乙腈、0.5%甲酸乙腈、1.0%甲酸乙腈、2.0%甲酸乙腈、纯乙腈作为提取溶剂，样品基质为上海青，添加水平为0.200 mg/kg，其他条件如1.2。考察甲酸浓度对20种酸性除草剂回收率的影响，结果见图2。纯乙腈、2.0%甲酸乙腈回收率都偏低，而0.2%甲酸乙腈、0.5%甲酸乙腈、1.0%甲酸乙腈都具有良好的提取效果，回收率都在满意的范围。本实验采用0.5%甲酸乙腈作为提取溶剂[17]。

*quantitative ion.

2.3.2 提取盐包的选择由于考察的20种酸性除草剂在水中的溶解度较大，除去更多的水可提高其在有机相中的分配比例。但除去过多的水会导致乙腈提取杂质过多，影响后续净化效果。本实验考察了两种盐包：(1)4.0 g MgSO4+1.0 g NaCl；(2)6.0 g MgSO4+1.0 g NaCl，样品基质为上海青，添加水平为0.200 mg/kg，其他条件如1.2。20种酸性除草剂的回收率见图3。方案(1)回收率范围为79.9%～107%，方案(2)回收率范围为69.5%～112%，故选用4.0 g MgSO4+1.0 g NaCl作为提取盐包[18]。

图2 乙腈中不同甲酸含量对回收率的影响Fig.2 Effects of different contents of formic acid in acetonitrile on recovery

图3 盐包中MgSO4不同含量对回收率的影响Fig.3 Effects of different contents of MgSO4 on recovery

图4 不同吸附剂配比对回收率的影响Fig.4 Effects of different adsorbents on recovery

2.3.3 分散固相萃取吸附剂的选择本方法采用分散固相萃取(dSPE)净化，将固相吸附剂直接加入样品提取液以吸附干扰物。常用的吸附剂有PSA、GCB、C18等。PSA去除糖类、脂肪酸和亲脂性色素等极性物质。C18去除维生素、色素、甾醇等非极性物质。GCB去除色素能力最强，但由于其表面的正六元环结构会吸附一些平面及对称结构的农药[19 - 20]。实验考察了3种吸附剂配方：(1)50 mg GCB+900 mg MgSO4；(2)100 mg GCB+900 mg MgSO4；(3)50 mg GCB+900 mg MgSO4+150 mg PSA，样品基质为上海青，添加水平为0.200 mg/kg，其他条件如1.2。20种酸性除草剂的回收率见图4。结果表明，方案(1)和(2)的回收率接近，GCB的增加没有降低回收率，说明GCB对本实验考察的20种除草剂吸附不强。50 mg GCB已可以净化色素含量较少的大部分蔬菜，如净化颜色较深的上海青、菠菜等色素多的蔬菜，也可以选择50 mg或者100 mg GCB。方案(3)和(1)相比，二氯吡啶酸、氯氟吡氧乙酸、二氯喹啉酸等回收率降低较多，其他除草剂回收率也整体降低。说明PSA明显吸附了考察的酸性除草剂。最终本实验不采用PSA，采用50 mg GCB+900 mg MgSO4吸附剂。

3 分析方法的评价

3.1 线性范围与定量限

配制0.005、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L的基质匹配系列混合标准工作溶液，在优化的条件下进行检验。以MRM定量离子的色谱峰面积(y)对分析物质量浓度(x，mg/L)建立标准曲线，溴苯腈在0.005～0.20 mg/L的范围内线性关系良好，其余19种酸性农药在0.005～0.50 mg/L的范围内线性关系良好，相关系数均在0.9939～0.9998之间，结果见表2。

同时取经检测不含待测目标农药化合物的上海青空白基质进行定量限的考察，以≥10倍信噪比(S/N)确定定量限(LOQ)，20种化合物的定量限均不高于0.05 mg/kg，能够满足蔬菜中农药残留的测定要求。

3.2 准确度与精密度

以黄瓜、番茄、豇豆、萝卜、芹菜为样品，进行添加回收和精密度实验。基于基质效应，采用空白基质提取液进行标准溶液的配制。结果表明，3个添加水平回收率范围为70.3%～107%，相对标准偏差(RSD)均不大于8.3%，见表3。方法的准确度和精密度均符合残留分析要求。

表2 20种农药的线性范围、线性方程、相关系数和测定低限(上海青基质)(n=6)

表3 5种基质中20种农药回收率和相对标准偏差(n=6)

(续表3)

CompoundSpiked levels(mg/kg)CucumberTomatoCowpeaTurnipCeleryRecovery(%) RSD(%)Recovery(%) RSD(%)Recovery(%) RSD(%)Recovery(%) RSD(%)Recovery(%) RSD(%)Bromoxynil1080.36.278.55.380.25.178.22.080.42.25082.05.281.22.880.55.381.51.380.54.310082.51.483.21.582.62.582.82.584.23.72,4-D1077.32.177.22.080.92.582.02.580.92.25082.24.081.61.582.52.081.61.382.21.010082.61.782.52.685.91.582.91.783.81.8MCPA1096.21.397.61.997.53.496.55.597.24.15096.91.498.81.598.54.9102 3.5102 3.5100102 2.8100 2.6105 3.4106 0.6104 0.22,4-DP10104 7.698.67.0101 6.5101 7.6100 3.650102 5.6101 3.2100 4.8102 2.9105 1.8100106 3.2107 4.2105 5.7106 3.5105 2.0MCPP1089.64.690.21.789.12.987.54.592.62.95093.61.895.72.594.02.589.23.293.71.310095.11.996.31.895.72.794.82.195.72.7Triclopyr1095.32.395.13.593.02.592.74.189.84.35097.51.096.21.595.82.197.51.596.21.610098.61.897.52.493.82.996.92.598.11.12,4,5-T5090.51.390.13.389.24.392.01.090.12.610095.60.996.22.095.12.695.11.895.04.620097.81.896.72.196.91.495.82.796.11.12,4-DB1082.35.781.02.881.93.380.66.281.55.35085.64.986.51.584.72.187.42.486.22.010088.52.589.23.787.24.589.42.586.81.5MCPB1090.24.387.23.292.12.091.63.890.02.05092.62.892.02.894.11.592.11.395.21.710095.72.596.02.095.21.195.22.497.10.92,4,5-TP1090.35.390.36.491.72.592.14.189.53.55092.52.792.42.594.23.693.82.894.02.010096.21.595.41.296.12.595.72.196.72.5

3.3 实际样品检测

应用本实验方法对在市场采购的上海青、黄瓜、番茄、豆芽、韭菜、萝卜、花椰菜、洋葱等蔬菜样品进行检测，分别在两批次上海青中检测出氟吡禾灵，检测值分别为0.012 mg/kg和0.015 mg/kg；一批次上海青中检测出喹禾灵，检测值为0.020 mg/kg；一批次韭菜中检测出氯氟吡氧乙酸，检测值小于0.050 mg/kg；五批次豆芽中检测出4-氯苯氧乙酸，检测值分别为0.210 mg/kg,0.124 mg/kg,0.234 mg/kg,0.083 mg/kg,0.158 mg/kg。

4 结论

本研究建立了同时测定蔬菜中20种酸性除草剂残留的LC-MS/MS检测方法。实验对提取溶剂、盐包、吸附剂、色谱条件和质谱条件分别进行了优化。结果表明,该方法操作简单，灵敏度高，准确性强，满足各种蔬菜基质的日常检测。