甲泼尼龙对单侧输尿管梗阻诱导的肾纤维化的影响

龙靖娴，潘毓敏，潘国律，黄容诚，彭 艳*

(1.广西师范大学 生命科学学院，广西 桂林 541006；2.广西师范大学 化学与药学学院，广西 桂林 541004)

慢性肾病(chronic kidney disease，CKD)是一种全球性的健康问题。CKD的常见病理机制是纤维化，肾小管萎缩和间质炎症[1-2]。肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis, RIF)是肾小管间质慢性损伤的一个过程，它几乎是所有的慢性肾脏疾病进展到转化为肾功能衰竭过程中的共同表现和主要的病理基础，RIF的主要特征为肾间质成纤维细胞过度增殖以及肾间质细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过度沉积。其中，含有α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)标记的肌成纤维细胞被认为是活化的成纤维细胞表型[3]。而ECM的成分比较复杂，其主要成分有Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、纤维连接蛋白(fibronectin, FN)等，因而在研究中常常通过检测这些蛋白的表达量来判断某组织是否发生细胞外基质的过度沉积。此外，随着研究的不断深入，发现肾小管间质发生纤维化不仅仅是由于肌成纤维细胞的过度增殖以及ECM的过度沉积，很多细胞因子和细胞信号通路的异常表达和转导在肾间质纤维化的发生机制都起到重要的作用[4]。其中，TGF-β/Smad信号通路的激活，特别是涉及Smad2和Smad3，是CKD的关键致病机制[5]。同时，肾脏炎症在肾脏疾病的进展中起着至关重要的作用[6]。核因子-κB(NF-κB)是炎症反应的中枢调节剂。NF-κB可刺激成纤维细胞的增殖和分化，并可诱导肾小管细胞的炎症和基质合成。

甲泼尼龙 (methylprednisolone sodium succinate，MPSS)为人工合成的糖皮质激素，可进入细胞核内与DNA结合，启动RNA的转录，继而合成各种酶蛋白。甲泼尼龙具有抗炎[7]、治疗肿瘤[8]、治疗休克[9]等作用。有研究发现，甲泼尼龙显著抑制TLR-4和NF-κB的激活，通过介导TLR-4/NF-κB途径的激活来抑制炎症反应[10]。同时，甲泼尼龙不仅具有抗炎的作用，还具有抗肺纤维化的作用[11-12]。然而，关于甲泼尼龙对于肾纤维化的治疗还未见报道。

单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)会导致肾间质纤维化，具体表现为肾间质成纤维细胞增殖并转化为肌成纤维细胞，间质中FN蛋白、Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白等过度沉积。随后UUO模型就逐步被广泛应用于肾脏纤维化的研究中。本文研究使用雄性Balb/c小鼠建立UUO模型，将甲泼尼龙应用于UUO模型小鼠，通过检测各组小鼠梗阻侧肾脏病理变化情况和肾纤维化标志性蛋白的表达，探讨甲泼尼龙对肾纤维化的改善作用。此外，我们检查了TGF-β/Smad和NF-κB信号通路蛋白的表达，拟阐明其潜在的分子机制。

1 材料与方法

1.1 动物与主要试剂

SPF级雄性Balb/c小鼠25只，体质量为18～20 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。实验小鼠饲养于SPF级环境，给予标准的饮食和饮水，于实验前12 h开始禁食。

甲泼尼龙购自Pfizer Manufacturing Belgium NV，批号H20130301。HE染色试剂盒和Masson染色试剂盒购自Solarbio公司。IHC染色试剂盒和а-Tubulin抗体购自中杉金桥公司。Col-1、Col3A1、NF-κB、HDAC1抗体购自Gene-Tex公司。FN、α-SMA抗体购自Sigma公司，Smad2/3、JNK抗体购自Cell Signaling公司。

1.2 动物分组和模型制备

将25只雄性Balb/c小鼠随机分为假手术组(Sham组)、模型组(UUO组)、低剂量组(给药剂量为3.625 mg/(kg·d)，MPSS-L组)、中剂量组(给药剂量为7.5 mg/(kg·d)，MPSS-M组)、高剂量组(给药剂量为15 mg/(kg·d)，MPSS-H)。通过腹腔注射体积分数10%的水合氯醛麻醉小鼠后，常规左侧腹部消毒准备。对模型组和给药组进行左侧输尿管结扎，假手术组开腹后游离左侧输尿管不予结扎。UUO模型标准化的关键在于无菌操作和结扎于输尿管上1/3处。对小鼠给药14 d，其中假手术组及模型组以等量脂肪乳进行腹腔注射，14 d后取左侧肾组织用于指标检测。

1.3 病理染色

1.3.1 HE染色

取出小鼠肾脏并用体积分数4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成3 μm厚度。石蜡切片常规脱蜡至水，进行HE染色，使细胞核中的染色质和细胞质中的核糖体着上蓝紫色，而酸性的伊红染料则将细胞质及其胞外基质着上红色。拍照成像，观察组织切片的病理情况。

1.3.2 Masson三色染色

取出小鼠肾脏并用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成3 μm厚度。石蜡切片常规脱蜡至水，进行Masson三色染色。Masson三色染色能够染胞核且能选择性地显示胶原纤维和肌纤维，即染色后胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。拍照成像，观察组织切片的病理情况。

1.3.3 IHC染色

将石蜡切片常规脱蜡至水，并浸入体积分数3%过氧化氢中以阻断内源性过氧化物酶活性。5%山羊血清封闭后，将切片与一抗4 ℃孵育过夜，然后孵育二抗15 min。切片经DAB显色后苏木素染核15 s，封片拍照成像，观察组织切片的病理情况。

免疫组化分数的评定标准：以胞浆或胞膜棕黄色颗粒状沉积为阳性。先按阳性细胞比例将无、1%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%分别计为0～4分；再按染色强度将无、弱、中、强分别计为0～3分，其中不着色0分，黄色1分，棕黄色2分，黄褐色3分；最后综合两部分得分相乘，总分最高为12分，分数越高，阳性越强。

1.4 蛋白质免疫印迹(Western blotting)

使用体积分数10%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(浓缩胶80 V、50 min，分离胶120 V、90 min)蛋白质样品，并转移到硝酸纤维素膜上。随后，用快速封闭液(购自碧云天)封闭1 h，洗涤后转至按适当比例配置(参考说明书进行)的一抗中，4 ℃孵育过夜。再次洗涤后孵育二抗2 h，使用超敏ECL化学发光试剂盒进行信号检测。

1.5 统计分析

采用SPSS软件进行统计分析，各指标采用均数±标准差(X±S)方式表示。采用t检验，P<0.05为差异显著，具有统计学意义。

2 结果

2.1 甲泼尼龙改善UUO小鼠肾间质纤维化

HE染色后小鼠肾间质纤维化程度结果见图1。由图1可见，假手术组小鼠左肾组织无明显变化，肾小球结构完整，未见肾小管萎缩或扩张，未出现肾间质胶原化的现象。如箭头所示，UUO组小鼠肾小球萎缩，部分肾小球可见纤维化呈分叶状，肾小管、肾小囊扩张明显。甲泼尼龙治疗组小鼠也可观察到肾小管和肾小囊扩张现象，但与UUO组相比肾小管的扩张等情况明显减轻。

Masson三色染色后蓝染的胶原沉积结果见图1。由图1可见，在假手术组中未观察到胶原沉积。然而，如箭头所示，UUO组的肾纤维化极为显著，蓝染色的肾纤维化区域增加。通过甲泼尼龙治疗的肾脏显示出蓝染区域减少，表明由UUO诱导的肾纤维化通过甲泼尼龙治疗后减弱。

每组n=5。比例尺代表100 μm。图1 甲泼尼龙对小鼠肾脏组织病理形态的影响Fig.1 Effect of MPSS on the pathological morphology of mouse kidney

2.2 甲泼尼龙降低UUO小鼠肾脏Col-1、Col3A1、α-SMA、FN的表达

RIF的主要特征为肾间质成纤维细胞过度增殖以及肾间质细胞外基质(ECM)的过度沉积。Western blotting检测小鼠左肾肾间质细胞外基质Col-1、Col3A1、FN和肌成纤维细胞的标志物α-SMA的表达，结果如图2所示。UUO小鼠肾脏Col-1、Col3A1、α-SMA和FN的表达量显著增加。然而，甲泼尼龙治疗后显著下调了Col-1、Col3A1、α-SMA和FN的表达，即甲泼尼龙可以改善UUO诱导的肾纤维化。其中β-Tubulin为对照并使用光密度分析进行定量(图2A)。

对于UUO组与Sham组，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。对于甲泼尼龙治疗组与UUO组，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001。(A)Col-1、Col3A1、α-SMA和FN的蛋白免疫印迹。(B)Col-1、(C)Col3A1、(D)α-SMA和(E)FN与β-Tubulin的相对比例。图2 甲泼尼龙对UUO小鼠肾脏Col-1、Col3A1、α-SMA和FN表达的影响Fig.2 Effects of MPSS on the expression of Col-1, Col3A1, α-SMA and FN in kidney of UUO mice

IHC染色结果也证实了Col-1、Col3A1、FN和α-SMA在小鼠肾组织中的表达，如图3。与Sham小鼠相比，UUO小鼠肾脏中Col-1、Col3A1、FN和α-SMA的表达量显著增加。与UUO组相比，甲泼尼龙治疗组中Col-1、Col3A1、FN和α-SMA的表达量均下调，可见甲泼尼龙治疗后减轻上述的变化。

对于UUO组与Sham组，**表示P<0.01，***表示P<0.001。对于甲泼尼龙治疗组与UUO组，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001。每组n=5。比例尺代表100 μm。(A)Col-1，Col3A1，α-SMA和FN的免疫组织化学染色。(B)Col-1、(C)Col3A1、(D)FN和(E)α-SMA的评分结果。图3 甲泼尼龙对UUO小鼠肾脏Col-1、Col3A1、α-SMA和FN表达的影响Fig.3 Effects of MPSS on the expression of Col-1, Col3A1, α-SMA and FN in kidney of UUO mice

2.3 甲泼尼龙抑制UUO中TGF-β/Smad的表达

TGF-β/Smad信号通路的激活，特别是涉及Smad2和Smad3，是CKD进展的关键致病机制。其中Smad构成TGF-β信号通路的核心。TGF-β的激活会诱导Smad2/3的表达上调，从而促进肾纤维化。因此，抑制TGF-β和Smad 2/3被认为是CKD治疗中涉及的主要机制[13]。Western blotting检测小鼠肾脏TGF-β/Smad信号传导的影响结果如图4。与Sham组相比，UUO显著上调TGF-β和下游组分Smad2/3、JNK的表达。与UUO组相比，甲泼尼龙治疗组中TGF-β、Smad2/3、JNK均下调。其中，β-Tubulin用作对照并使用光密度分析进行定量(图4A、B)。

IHC染色后，检测构成TGF-β信号通路的核心Smad2/3在小鼠肾组织中的表达结果如图5。与Sham组相比，UUO组Smad2/3的表达量显著增加。与UUO组相比，甲泼尼龙治疗组中Smad2/3表达下调。

对于UUO组与Sham组，**表示P<0.01，***表示P<0.001。对于甲泼尼龙治疗组与UUO组，##表示P<0.01，###表示P<0.001。(A)Smad2/3、JNK和(B)TGF-β的蛋白免疫印迹。(C)TGF-β、(D)Smad2/3和(E)JNK与β-Tubulin的相对比例。图4 甲泼尼龙对UUO小鼠肾脏TGF-β/Smad信号传导的影响Fig.4 Effect of MPSS on TGF-β/Smad signal transduction in kidney of UUO mice

对于UUO组与Sham组，*表示P<0.05。对于甲泼尼龙治疗组与UUO组，#表示P<0.05，##表示P<0.01。每组n=5。比例尺代表100 μm。(A)～(E)Smad2/3的免疫组织化学染色。(F)Smad2/3的评分结果。图5 甲泼尼龙对UUO小鼠肾脏Smad2/3表达的影响Fig.5 Effect of MPSS on the expression of Smad2/3 in kidney of UUO mice

2.4 甲泼尼龙下调UUO中的NF-κB信号传导途径

核因子-κB(NF-κB)是炎症反应的中枢调节剂。NF-κB可以被许多因素刺激，NF-κB的赖氨酸残基脱乙酰化在NF-κB介导的基因表达的调节中起关键作用，所以组蛋白去乙酰化酶(HADC)是影响NF-κB活性的一个重要机制[14]。Western blotting分析小鼠肾脏HADC1和NF-κB表达水平的结果如图6。HADC1和NF-κB在UUO组中的表达水平显著高于Sham组。与UUO组相比，甲泼尼龙治疗组中HADC1和NF-κB表达下调。其中，β-Tubulin为对照并使用光密度分析进行定量(图6A)。

对于UUO组与Sham组，*表示P<0.05，**表示P<0.01。对于甲泼尼龙治疗组与UUO组，#表示P<0.05，###表示P<0.001。(A)HADC1和NF-κB的蛋白免疫印迹。(B)NF-κB和(C)HADC1与β-Tubulin的相对比例。图6 甲泼尼龙对UUO小鼠肾脏NF-κB信号传导的影响Fig.6 Effect of MPSS on NF-κB signal transduction in UUO mice

IHC染色后检测HADC1、NF-κB在肾组织中的表达的结果如图7。与Sham组相比，UUO组HADC1、NF-κB的表达显著增加。与UUO组相比，甲泼尼龙治疗组中HADC1、NF-κB表达下调。

https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/western-blot对于UUO组与Sham组，*表示P<0.05，***表示P<0.001。对于甲泼尼龙治疗组与UUO组，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001。每组n=5。比例尺代表100 μm。(A)HADC1和NF-κB的免疫组织化学染色。(B)HADC1和(C)NF-κB的评分结果。图7 甲泼尼龙对UUO小鼠肾脏HADC1、NF-κB表达的影响Fig.7 Effect of MPSS on the expression of HADC1 and NF-yB in kidney of UUO mice

3 讨论

甲泼尼龙是一种合成的糖皮质激素，具有很强的抗炎、免疫抑制及抗过敏活性，能通过抑制细胞因子和炎症介质的释放，减少平滑肌增生，减轻炎症反应。本文研究的主要发现是，在UUO小鼠模型中，甲泼尼龙能够改善肾纤维化，并且进一步实验证明甲泼尼龙通过TGF-β/Smad和NF-κB信号传导减弱了UUO诱导的肾纤维化。

肾间质纤维化是各种进行性肾病的形态学标志，并且被认为是导致终末期肾衰竭的最终共同途径。肾纤维化的发病机制主要特征是肾小管萎缩，肌成纤维细胞积聚和过度ECM沉积[15]。肾组织中的肌成纤维细胞被认为是ECM的主要来源。本文的研究结果显示，UUO小鼠肾脏间质纤维化标志物α-SMA的表达增加，用甲泼尼龙处理能显著降低α-SMA表达。在本文研究中，甲泼尼龙治疗的小鼠与UUO模型小鼠相比，Col-1、Col3A1、FN表达显著降低，表明甲泼尼龙对肾功能有一定的保护作用。因此，我们认为甲泼尼龙对肾间质纤维化的影响似乎与ECM成分合成的减少直接相关。

TGF-β/Smad信号传导途径是诱导肾纤维化的重要途径，其下游Smad和非Smad信号传导途径显著诱导肾瘢痕形成。最近关于TGF-β信号通路的功能作用的报道[16]改变了人们对肾间质纤维化和CKD炎症的分子机制的理解。许多研究者已经证明TGF-β是CKD最重要且最强烈的纤维化诱导因子[1，17-19]。TGF-β对肾脏的促纤维化作用可通过几种可能的机制发生，例如肌成纤维细胞的激活、过度ECM沉积和抑制的ECM降解[20]。Smad构成了TGF-β信号通路的核心。TGF-β的激活会诱导Smad2/3的表达上调，从而促进肾纤维化。因此，抑制TGF-β和Smad2/3被认为是CKD治疗中涉及的主要机制[13]。本文研究结果发现，UUO小鼠模型显著上调TGF-β、Smad2/3和JNK的表达水平。与UUO模型小鼠相比，用甲泼尼龙治疗的UUO小鼠肾脏中这些组分的表达量显著降低了，这表明甲泼尼龙可以通过TGF-β/ Smad信号通路减轻UUO诱导的肾纤维化。

NF-κB是许多炎症的重要调节因子。NF-κB通路在炎症性肠病、类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘等慢性炎症疾病中发挥重要作用[21]。NF-κB可以被许多因素刺激，例如，组蛋白去乙酰化酶(HADC)。据报道，NF-κB的乙酰化在调节炎症反应的强度、长度和特异性方面起着至关重要的作用[22]。NF-κB的赖氨酸残基脱乙酰化在NF-κB介导的基因表达的调节中起关键作用[14]。因此，HDAC去除NF-κB的乙酰化，是影响NF-κB活性的一个重要机制。所以，HADC1通过影响NF-κB的表达，从而调控炎症，影响肾纤维化机制。本文研究观察到甲泼尼龙显著降低了UUO小鼠模型中诱导的HADC1的蛋白质水平。同时，研究发现，与UUO模型小鼠相比，用甲泼尼龙治疗的UUO小鼠肾脏中NF-κB的表达量明显降低，这表明甲泼尼龙抑制HADC1的表达，其影响NF-κB的表达并最终改善肾脏炎症，从而改善UUO诱导的肾纤维化。

综上，本文研究结果表明甲泼尼龙可以通过TGF-β/Smad和NF-κB信号通路减轻UUO诱导的肾纤维化。